復合風味蛋白酶提取籽瓜種子蛋白工藝的優化

曹承旭，趙春燕，馬　越，趙曉燕，張　超

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽　110866；2.北京市農林科學院蔬菜研究中心，果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室，農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，農業部都市農業（北方）重點實驗室，北京　100097）

復合風味蛋白酶提取籽瓜種子蛋白工藝的優化

曹承旭1，趙春燕1，馬越2，趙曉燕2，*張超2

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110866；2.北京市農林科學院蔬菜研究中心，果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室，農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，農業部都市農業（北方）重點實驗室，北京100097）

以加酶量、酶解溫度、酶解時間為影響因素，蛋白質提取率為響應值，設計三因素三水平的響應面設計優化復合風味蛋白酶提取籽瓜種子蛋白質的提取工藝。結果顯示，加酶量對蛋白質提取率影響最大，其次是酶解溫度和酶解時間。響應面分析模型顯示，籽瓜種子蛋白質提取最佳工藝為加酶量0.22%，酶解溫度59℃，酶解時間3.29 h，在該工藝下籽瓜種子蛋白質提取率為98.2%，與實際蛋白質提取率的相對偏差僅為0.80%，該模型真實可靠。

蛋白質；提取；籽瓜種子；復合風味蛋白酶

0　引言

籽瓜又名打瓜，葫蘆科，一年生草本植物［1］，主要取籽炒制而食。籽瓜種子含有蛋白質、脂肪、VB 和VD等營養物質［2］，其蛋白質含量達30%～45%［3］。本項目組前期比較發現籽瓜種子中蛋白質含量高于大豆、花生和葵花籽，并且其中必需氨基酸配比比大豆更接近于FAO推薦比例［4］，因此籽瓜種子是一種優質的蛋白質資源。

酶法提取蛋白質的最大優勢在于獲得蛋白質資源的同時，改善蛋白質的溶解性和生理功能特性，拓寬蛋白質的應用領域［5］。本項目組前期考察了4種蛋白酶對籽瓜種子蛋白質提取率的影響，發現堿性蛋白酶提取率最高，其次是復合風味蛋白酶和中性蛋白酶［6］。但是，堿性蛋白酶在水解過程中常常會產生苦味肽［7］。而采用復合風味蛋白酶水解大豆和肉類蛋白質后，水解液中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸等支鏈氨基酸含量，以及谷氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸等呈味氨基酸含量豐富，未發現苦味肽［8-10］。因此，項目組以籽瓜種子為原料，利用復合風味蛋白酶提取籽瓜種子蛋白質。研究采用單因素試驗結合響應面中心組和試驗設計，研究酶解工藝對蛋白質提取率的影響，獲得最佳籽瓜種子蛋白提取工藝，為籽瓜種子蛋白質的開發利用提供數據及理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

籽瓜種子，新疆九豐種業有限責任公司提供；復合風味蛋白酶，江蘇銳陽生物科技有限公司提供。

1.2儀器與設備

RT5型加熱磁力攪拌器，德國IKA公司產品；AL204型電子天平、FE20型實驗pH計，METTLER TOLEDO公司產品；3-18K型冷凍離心機，德國SIGMA公司產品；FW100型萬能粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司產品。

1.3蛋白質含量測定方法

采用凱氏定氮法測定籽瓜種子總蛋白含量；采用考馬斯亮藍方法測定提取液中蛋白質含量［11］。

1.4工藝流程

籽瓜種子去殼后利用萬能粉碎機打碎，采用正己烷脫脂［12］，干燥后獲得籽瓜種子脫脂粉，取20 g脫脂粉按一定料液比混合、攪拌，利用0.1 mol/LNaOH溶液調節混合液pH值，使用水浴鍋控制混合液溫度，當pH值與溫度達到設定條件后，按照一定比例加入復合風味蛋白酶繼續攪拌，同時監控水解液的pH值和溫度，每30 min將混合液pH值調節至設定pH值，提取結束后迅速將混合液加熱至100℃，保持5 min，然后將混合液以轉速8 000 r/min離心20 min，測定上清液的體積和蛋白質含量，蛋白質提取率的計算如下。

1.5單因素試驗設計

分別考察料液比、加酶量、酶解溫度、酶解pH值和酶解時間對蛋白質提取率的影響。①料液比，取料液比1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，加酶量0.1%，酶解溫度50℃，酶解pH值7，酶解時間3 h；②加酶量，按加酶量0.05%，0.10%，0.20%，0.30%加入復合風味蛋白酶，料液比1∶8，酶解溫度50℃，酶解pH值7，酶解時間3 h；③酶解溫度，按溫度30，40，50，60℃進行酶解，料液比1∶8，加酶量0.10%，酶解pH值7，酶解時間3 h；④酶解pH值，按pH值4，5，6，7，8進行酶解，料液比1∶8，加酶量0.10%，酶解溫度50℃，酶解時間3 h；⑤酶解時間，按時間4，5，6，7，8 h進行酶解，料液比1∶8，加酶量0.10%，酶解溫度50℃，酶解pH值7。

1.6響應面試驗設計

在單因素研究的基礎上，選取加酶量、酶解溫度、酶解時間為自變量，以蛋白質提取率為響應值，優化籽瓜種子蛋白提取工藝的最佳參數，采用SAS 9.2統計分析軟件對試驗數據進行分析。

響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1　響應面試驗因素與水平設計

2　結果與分析

2.1料液比對籽瓜種子蛋白質提取率的影響

料液比對籽瓜種子蛋白質提取率的影響見圖1。

圖1　料液比對籽瓜種子蛋白質提取率的影響

由圖1可知，當料液比達到1∶10之前，蛋白質提取率隨著料液比增大而增大；當料液比超過1∶10之后趨于平緩。水酶法提取蛋白質過程中水量的增加對酶解有著積極的作用，但是過量的水會導致酶與底物的相對含量變少，以致酶與底物接觸幾率降低，酶解的作用變差［13］，所以選擇料液比1∶10最為適宜。

2.2加酶量對籽瓜種子蛋白質提取率的影響

加酶量對籽瓜種子蛋白質提取率的影響見圖2。

圖2　加酶量對籽瓜種子蛋白質提取率的影響

由圖2可知，隨著加酶量的增大，酶與底物的作用就越充分，但是考慮到復合風味蛋白酶的價格較為昂貴，所以選擇加酶量在0.20%時提取籽瓜種子蛋白質最為合適。

2.3酶解溫度對籽瓜種子蛋白質提取率的影響

酶解溫度對籽瓜種子蛋白質提取率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著酶解溫度的增加，蛋白質的提取率逐漸增大。但是酶解溫度過高可能會使酶發生變性，因而導致蛋白質提取率降低，所以當酶解溫度在60℃時提取籽瓜種子蛋白質最為適宜。

圖3　酶解溫度對籽瓜種子蛋白質提取率的影響

2.4酶解pH值對籽瓜種子蛋白質提取率的影響

酶解pH值對籽瓜種子蛋白質提取率的影響見圖4。

圖4　酶解pH值對籽瓜種子蛋白質提取率的影響

由圖4可知，隨著溶液初始酶解pH值的增大，籽瓜種子蛋白質的提取率呈現上升趨勢；當達到酶解pH值7之后呈下降趨勢。說明在復合風味蛋白酶水解過程中，保持水解液的酶解pH值7最為適宜。

2.5酶解時間對籽瓜種子蛋白質提取率的影響

酶解時間對籽瓜種子蛋白質提取率的影響見圖5。

圖5　酶解時間對籽瓜種子蛋白質提取率的影響

由圖5可知，隨著酶解時間的增加，蛋白質的提取率先升高后降低，在酶解時間3 h時蛋白質的提取率達到最大。由于在水解的過程中，酶主要作用于細胞壁和原生質，使細胞原生質內的蛋白質與油一同溶出，隨著酶解時間的增加，油不斷地流出，使得水溶液體系中形成乳化層，最終導致蛋白質提取率降低。因此，最適的酶解時間為3 h。

2.6響應面分析方案與結果

將所得的試驗數據采用SAS 9.2軟件進行多元回歸擬合，得到以蛋白質提取率為目標函數的二次回歸方程：

Y=98.19+10.40A-9.86B+4.72C+6.57AB+8.54AC+ 9.12BC-26.90A2-30.72B2-10.14C2.

復合風味蛋白酶水解提取籽瓜種子蛋白響應面試驗結果見表2，回歸方程的方差分析見表3。

表2　復合風味蛋白酶水解提陬籽瓜種子蛋白響應面試驗結果

表3　回歸方程的方差分析

方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.001），失擬項不顯著，并且該模型R2=96.9%，R2Adj=92.8%說明該模型與試驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，試驗誤差小，可以用此模型來分析和預測水酶法提取籽瓜種子蛋白的結果。由此可以認為，上面給出的二次回歸方程模型是合適的。由F檢驗可以得到因素貢獻率為A＞B＞C，即加酶量＞酶解溫度＞酶解時間。

加酶量和酶解溫度對籽瓜種子蛋白質提取率影響見圖6。

圖6　加酶量和酶解溫度對籽瓜種子蛋白質提取率影響

在選取的各因素范圍內，通過Design Expert軟件分析，圖6顯示不同交互作用對蛋白質提取率的影響，在試驗范圍內尋找蛋白質提取率最高點為加酶量0.22%，酶解溫度59℃，酶解時間3.29 h，蛋白質提取率的預測值為99.0%。按最優組合方案中的提取條件進行驗證試驗，重復3次，取平均值，測得籽瓜種子蛋白質提取率為98.2%，與理論值99.0%接近，其相對誤差為0.80%，進一步驗證了數學回歸模型的正確性。

3　結論

研究以加酶量、酶解溫度、酶解時間為影響因子，以蛋白質提取率為響應值，結果顯示加酶量對蛋白質提取率影響最大，其次是酶解溫度和酶解時間；響應面分析模型顯示籽瓜種子蛋白質提取的最佳工藝為加酶量0.22%，酶解溫度59℃，酶解時間3.29 h，在該工藝下籽瓜種子蛋白質提取率為98.2%，與實際蛋白質提取率的相對偏差僅為0.80%，模型真實可靠。

［1］谷雅卿.黑瓜子 ［J］.農業科學實驗，1982（3）：34-35.

［2］程瑛琨，孟慶繁，陳亞光，等.籽瓜多種營養成分的分析 ［J］.食品研究與開發，2006，27（7）：169-171.

［3］鄧芝串，張超，張暉，等.黑籽瓜種子蛋白質的功能特性 ［J］.食品工業科技，2014，35（10）：115-119.

［4］張超，郭曉飛，李武，等.籽瓜種子蛋白質組成及其提取工藝優化的研究 ［J］.中國糧油學報，2013，28（9）：119-123.

［5］李楊，江連洲，王勝男，等.水酶法提取榛子蛋白工藝優化 ［J］.食品科學，2012，33（2）：143-148.

［6］羅述博，張超，趙曉燕，等.水酶法提取籽瓜種子油脂工藝的優化 ［J］.中國糧油學報，2012，27（12）：73-77.

［7］Wang Long，Wu Jianer，Ye Kenan.Optimization of enzymatic hydrolysis of proteins from tilapia（Oreochromis niloticus） head by flavourzyme TM protease［J］.食品科學，2006，27（11）：304-310.

［8］周劍忠，陳曉紅.復合酶水解乳鴿肉的研究 ［J］.食品與發酵工業，2002，28（12）：41-44.

［9］黃開紅，李瑩，周劍忠，等.復合蛋白酶水解大豆制備大豆肽工藝的研究 ［J］.江蘇農業科學，2007（4）：84-86.

［10］張根生，何麗瑩，岳曉霞，等.風味蛋白酶與復合蛋白酶分步水解脫脂碎肉粉工藝的優化 ［J］.中國調味品，2011，36（1）：17-21.

［11］張水華.食品分析 ［M］.北京：中國輕工業出版社，2004：97-108.

［12］楊柳，江連洲，李楊，等.蛋白酶對水酶法提取大豆油脂及蛋白質的影響研究 ［J］.食品工業科技，2009，30（10）：240-243.

［13］Sajid Latif，Farooq Anwar.Aqueous enzymatic sesame oil and protein extraction［J］.Food Chemistry，2011，125：679-684.◇

Optimization of Protein Extraction from Seed of Seed-watermelon by Flavourzyme

CAO Chengxu1，ZHAO Chunyan1，MA Yue2，ZHAO Xiaoyan2，*ZHANG Chao2
（1.College of Food Science，Shenyang Agricultural Univrtsity，Shenyang，Liaoning 110866，China；2.Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences；Beijing Key Laboratory of Fruits and Vegetable Storage and Processing；Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（North China），Ministry of Agriculture；Key Laboratory of Urban Agriculture（North），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China）

The protein extraction from the seed of seed-watermelon by flavourzyme is optimized by surface respond experiment. The protein extraction process is optimized by the response surface of 3 factors and 3 levels.Results indicate that the enzyme amount is the key factor on the protein extraction rate，followe by enzymatic hydrolysis temperature and hydrolysis time.The optimum extraction parameters is the enzyme amount of 0.22%，temperature of 59℃，and enzyme hydrolysis time of 3.29 h. The protein extraction rate reaches 98.2%under the optimum parameters.The validation experiment proved that the surface respond model is reliable with the relative deviation of 0.80%.

protein；extraction；the seed of seed-watermelon seed；flavourzyme

TS201

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.08.011

1671-9646（2016）08a-0033-04

2016-06-01

現代農業產業技術體系建設專項資金項目（CARS-26&CARS-25）；北京市農林科學院科技創新能力建設專項新學科培養項目（KJCX20140204）；果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室項目（Z141105004414037）。

曹承旭（1992— ），女，碩士，研究方向為食品科學。

張超（1978— ），男，博士，副研究員，研究方向為農產品加工。