志賀菌實驗室快速分子檢測與分析*

陜西省疾病預防控制中心(西安710054)

石　一　張　錚　張　義　馬國柱　劉長宏　陳　颯　劉　峰　劉東立▲

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志賀菌實驗室快速分子檢測與分析*

陜西省疾病預防控制中心(西安710054)

石一張錚張義馬國柱劉長宏陳颯劉峰劉東立▲

目的：探討群體性感染性腹瀉的發生病因。方法：采用試劑盒和多重PCR的方法進行快速檢測。結果：核酸結果顯示志賀菌陽性， ipaH毒力基因陽性。結論：此次感染是一起由志賀菌引起的痢疾暴發疫情，多重PCR方法相比傳統細菌培養的方法更加快捷。

主題詞腹瀉/病因學腹瀉/診斷志賀菌屬/診斷聚合酶鏈反應@快速檢測

2015年10月中旬，陜西省彬縣某幼兒園多名兒童出現發熱、腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐、頭痛等癥狀，先后28例兒童入院，其中1例兒童癥狀較重入住小兒ICU，經過現場流行病學調查、臨床診斷和實驗室檢測，懷疑此次疫情可能是由志賀菌引起的一起細菌性痢疾暴發，現將實驗室檢測結果分析報告如下。

材料與方法

1標本與試劑

1.1標本來源：共收集標本22份，其中病人標本10份，環境標本12份。

1.2試劑來源：Mac平板購自梅里埃生物制品有限公司，GN生化鑒定卡由法國梅里埃公司生產，核酸提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，韓國Seeplex腹瀉多重PCR試劑盒購自杭州紐羅西敏生物科技有限公司，DNA引物委托上海生工合成。

1.3 儀器：法國梅里埃公司VITEK2全自動生化分析儀。

2方法

2.1常規培養：將所有標本接種Mac平板，36℃培養24h，挑取可疑菌落，進行生化試驗。生化分析采用法國梅里埃公司VITEK2全自動生化分析儀進行分析。

2.2核酸提取：核酸提取使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒進行實驗，提取方法按照說明書進行。

2.3Seeplex腹瀉多重PCR檢測：首先使用Diarrhea-B1 ACE Detection試劑盒對所提核酸進行多重PCR擴增，實驗方法參照說明書，然后對擴增產物使用2%瓊脂糖進行電泳檢測，電壓120V，電泳時間1h。

2.4志賀菌毒力基因檢測：委托上海生工合成志賀菌SET1、SET2、ial、ipaH毒力基因PCR引物，具體引物序列[1]見表1。PCR反應采用25μl擴增體系，模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，2×Taq MasterMix 12.5μl，ddH2O補至25μl。四種毒力基因PCR循環參數相同，95℃ 5min，95℃ 50s，56℃ 50s，72℃

表1　志賀菌4種毒力基因引物序列

60s，30個循環，72℃ 7min[1]。擴增產物使用1%瓊脂糖進行電泳檢測，電壓120V，電泳時間30min。

結　果

1現場流行病學調查結果本次流行病學調查44例，其中男24例，女20例，男女比例為1.2∶1。發病年齡3～6歲，發病最多年齡的是5歲(61.36%)。病例多集中在二樓廁所周圍的3個班級，罹患率分別為17.54%、15.38%、24.56%，該樓層沒有流水洗手設施。首例病例的發病時間為12日上午8時，15日晚病例數迅速增加，16日8時至16時達發病高峰，17日病例數開始迅速減少，病例主要集中在16日。

2分離培養結果可疑菌落經VITEK2生化鑒定均為大腸埃希菌，未分離到志賀菌。

3試劑盒檢測結果對部分病人和環境標本采用Seeplex腹瀉病多重PCR試劑盒檢測結果顯示：4份病人標本志賀菌核酸陽性，2份環境標本志賀菌核酸陽性(包括1份便池標本和1份洗手盆標本)。見圖1～2。

圖1Diarrhea-B1 ACE Detection試劑盒PCR擴增結果(1～9患者，10～13環境)

圖2Diarrhea-B1 ACE Detection試劑盒PCR擴增結果(1～9環境)

4毒力基因檢測結果挑取部分病人和環境標本進行志賀菌毒力基因檢測，結果顯示：上述4份病人標本均擴增出志賀菌ipaH基因條帶，其中2例病人同時擴增出SET1基因條帶，還有1例病人擴增出混合條帶(15號)。見圖3。

圖34種毒力基因PCR擴增結果(1～4，15患者，5～14環境)

討　論

志賀菌為革蘭陰性桿菌，胞內致病，具有高度的傳染性危害嚴重。據2011年中國重點傳染病和病媒生物監測報告的統計，2011年全國共報告細菌性痢疾病例236321例，死亡23例，發病率17.62/10萬，病死率0.0096%。陜西省2011年報告的痢疾病例數為9559例，死亡1例，病死率0.01%，發病率高居法定甲、乙類傳染病報告前三名，嚴重的影響了人們的生產生活。該菌主要危害兒童，尤其是5歲以下的幼兒，病死率3%～ 5%。

志賀菌是由一個環狀染色體和環狀大質粒組成的，其上含有的毒力基因決定了志賀菌的致病性[2]，ipaH 基因、SET 1 基因、SET 2 基因、ial 基因已經確定與人類疾病相關。ipaH 基因一般被用來鑒定志賀菌。ial位于大質粒上一般與侵襲性相關。SET 1和 SET 2是兩種常見的志賀氏菌腸毒素，SET 1熱穩定，SET 2部分能與志賀腸毒素的抗血清發生中和。本次實驗4例病人均擴增出了ipaH基因條帶，與韓國Seeplex腹瀉病多重PCR試劑盒的結果一致，其中2例同時擴增出SET1基因條帶，還有1例擴增出SET1基因，但未擴增出ipaH基因條帶。未擴增出ipaH基因條帶的病人標本有待我們進一步的分析。而對于環境標本，Seeplex腹瀉病多重PCR試劑盒檢測出兩份志賀氏菌核酸陽性，但毒力基因檢測并未擴增出任何條帶，可能是由于引物設計的不同。

傳統細菌培養的方法一直被認為是確定病原菌的金標準。然而現在由于抗生素的大量使用，很多標本很難分離培養出真正的病原菌。隨著 PCR技術的出現，尤其是熒光定量PCR技術的出現[3]，彌補了很多傳統實驗方法上的不足，而且更加便捷。感染性腹瀉是突發公共衛生事件中最常見的一種，如何快速確定病因至關重要，現在針對各種病原菌的商用PCR檢測試劑盒，熒光定量PCR檢測試劑盒非常多，檢測的毒力基因各不相同，靈敏度差異也很大，如何既能提高我們的檢測效率，又能準確確定病因，是我們亟待思考的問題。

[1]胡守奎，胡萬富，王敏，等. 安徽省2008-2010年宋內氏志賀菌分子流行病學分析[J].中華疾病控制雜志，2013，17(11)：959-962.

[2]冉丹丹，于學輝，宋定州，等.志賀菌毒力相關因子研究現狀[J].西南民族大學學報自然科學版，2012，38(3)：390-395.

[3]Xia S，Xu B，Huang L，etal. Prevalence and characterization of human shigella infections in Henan province，China，in 2006[J].Clin Microbiol，2011，49(1) : 232-242．

(收稿：2016-06-10)

Rapid detection and analysis in an outbreak of infectious diarrhea caused by Shigella spp

Shaanxi Province Center for Disease Control and Prevention(Xi’an 710054)

Shi YiZhang ZhengZhang Yi et al

Objective: To analysis the cause of an outbreak of infectious diarrhea in Binxian County, Xianyang.Methods: Cultured according to the GB4789.5-2012, meanwhile Seeplex kit and the method of multiplex PCR was used for rapid detection.Results: Nucleic acid showed Shigella virulence gene positive ipaH positive.Conclusion: The outbreak was caused by Shigella spp.Seeplex and the multiplex PCR method compared with the traditional bacterial cultured method are more efficient.

Diarrhea/etiologyDiarrhea/diagnosisShigella/diagnosisPolymerase chainreaction@Rapid detection

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.075

*陜西省衛生和計劃生育委員會衛生科研項目(D11)