復合酶法提取芹菜籽油的新技術研究

徐國良，李雄輝，袁菊如，胡居吾，涂招秀

（江西省科學院，江西南昌 330096）

復合酶法提取芹菜籽油的新技術研究

徐國良*，李雄輝，袁菊如，胡居吾，涂招秀

（江西省科學院，江西南昌 330096）

芹菜籽為原料，采用單因素法與正交設計法對復合酶法提取芹菜籽油的工藝條件進行優選，并對自提的芹菜籽油化學成分進行GC-M S分析，實驗結果表明最佳工藝條件為：選擇中性蛋白酶和中溫α淀粉酶（1∶1比例）復合使用，酶添加量為1.7%，料液比1∶6，pH為6.2，55℃酶解4h。在此工藝條件下，芹菜籽油的提取率45.6%，芹菜籽油總得率為4.1%；用GC-M S從芹菜籽油中共鑒定出23種化合物。

芹菜籽；芹菜籽油；復合酶法；纖維素酶；α-淀粉酶；酶法提取

1 高脂血癥的危害

對人體來說，高脂血癥的危害很大。大量研究已證實，血脂過高是加速動脈粥樣硬化多個因素中的最危險（易患）因素。高脂血癥是腦卒中、冠心病、心肌梗死、心臟猝死等的危險因素。

芹菜籽所含降壓、降脂成分是芹菜的50倍，芹菜、芹菜籽油對腦衰老和腦缺血具有防治作用。研究表明，芹菜籽中油脂含量豐富，含有多種藥理活性成分，具有散氣、消腫、利尿、抗腫瘤及抗衰老等功效。現已有研究從多個方面研究了芹菜籽油的藥理作用[1-3]。

2 研究方法及工藝參數的選擇

2.1 原料

芹菜籽（旱芹的種子，購于洪城大市場）。

2.2 儀器與試劑

果膠酶（1萬U/g）、纖維素酶（1萬U/g）、堿性蛋白酶（20萬U/g）、中性蛋白酶（20萬U/g）、中溫α淀粉酶（1萬U/g）及耐高溫α淀粉酶（1萬U/g）均購于南寧東恒華道生物科技有限責任公司；BSA223S分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司；Anke TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠。

2.3 試驗方法

2.3.1 芹菜籽預處理

將芹菜籽挑選、去除雜物，置于-60℃冰箱中放置2h后，立刻粉碎，備用。

2.3.2 芹菜籽成分的測定

1）水分的測定：取適量芹菜籽，快速粉碎，立即用水分測定儀測定芹菜籽中的水分含量。平行測定3次，取平均值。

2）粗脂肪的測定：參考GB/T 5512-2008，食品中粗脂肪的測定（索氏抽提法）。

3）分光度法。

2.3.3 芹菜籽油理化性質的測定

1）折光指數的測定：參照GB/T 5527-2010動植物油脂折光指數的測定[4]。

2）過氧化值（POV值）的測定：參照GB/T5538-2005動植物油脂過氧化值測定[5]。

3）酸值的測定：參照GB/T 5530-2005動植物油脂酸值和酸度測定[6]。

4）皂化值的測定：參照GB/T 5534-2008動植物油脂皂化值的測定[7]。

5）碘值的測定：參照GB/T 5532-2008動植物油脂碘值的測定[8]。

2.3.4 芹菜籽油提取工藝流程

芹菜籽→干燥粉碎→加水并調節pH→微波30s→超聲400W 10min→加酶，適宜溫度酶解→升溫滅酶→ 冷卻→離心分離→ 芹菜籽油。

其中，芹菜籽提取率的計算公式如下：Y(%)＝W1/W2×100%。式中，Y—提取率；W1—提取芹菜籽油質量，g；W2—粉碎的芹菜籽含油質量，g。

2.3.5 芹菜籽油脂肪酸組成GC-MS分析

2.3.5.1 甲酯化

采用H2SO4-CH3OH水浴法，稱取約0.2g芹菜籽油于25mL具塞試管中，加入5% H2SO4-CH3OH溶液2mL，震蕩使充分均勻，于60℃水浴甲酯化反應20min，冷卻后加入C6H142mL，收集C6H14層（淡黃色），加入少量無水Na2SO4（目的是脫水），密封備用。

2.3.5.2 GC-MS分析

氣相色譜條件：色譜柱為DB-35MS彈性石英毛細管色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）初始溫度為65℃保持2min，毛細管柱采用程序升溫，升溫速率5℃/min至250℃，保持20min，進樣口溫度為250℃，載氣為氦氣，載氣流速為1.2mL/min，分流比為20∶1，氣化室及檢測器的溫度均為300℃。

3 結果與分析

3.1 芹菜籽組成成分分析

采用粉碎過80目篩后的芹菜籽為原料進行成分測定，結果如表1所示。

表1 芹菜籽組成

3.2 單因素實驗結果

3.2.1 不同酶對提取率的影響

以過80目篩的芹菜籽為原料，分別選用果膠酶、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、中溫α淀粉酶及耐高溫α淀粉酶，酶用量為2%，料液比為1∶5 （g/mL），酶解時間為4h，pH和溫度均為所用酶的最佳值，酶解完成后于90℃滅酶10min，冷卻后于4 000r/min離心20min，取上層清液再離心20min后得上層液，計算出芹菜籽油的提取率，結果見圖1。

圖1 酶的種類與提取率的關系

由圖1可知，單獨使用酶的提取率均不佳，效果最好的為中性蛋白酶，其提取率為16.06%（未達60.00%），其次為中溫α淀粉酶，其提取率為10.45%，其余酶的提取率均不高。因此，選擇中性蛋白酶和中溫α淀粉酶（1∶1比例）復合使用，以提高酶解速度，減小酶用量。

3.2.2 酶用量對芹菜籽油提取率的影響

分別使用0.50%、1.00%、1.50%、2.00%和2.50%的中型蛋白酶和中溫α淀粉酶（1∶1比例），不同酶用量下的芹菜籽油提取率結果如圖2所示。

圖2 酶用量對芹菜籽油提取率的影響

從圖2可以看出，隨著酶添加量的增加，芹菜籽油的提取率也隨之升高。酶添加量在1.50%～2.00%時，芹菜籽油提取率變化較小。當酶添加量超過2.00%后，油脂的提取率增加幅度很小，說明繼續增加酶添加量已無意義。從經濟性角度考慮，確定1.50%的比例為最佳酶添加量。

3.2.3 料液比對芹菜籽油提取率的影響

固定酶解溫度為55℃，酶解時間為4h，酶解pH 為6.0，只改變料液比，測定芹菜籽油提取率的結果如圖3所示。

圖3 料液比對芹菜籽油提取率的影響

由圖3可知，料液比對芹菜籽油的提取率油重要影響，料液比在1∶6以下時，油脂的提取率呈上升趨勢。這可能是由于料液比較小時，底物中漿液粘度大，體系流動性差，提取率低；隨著料液比的增大，底物濃度和酶濃度達到最優時，提取率最大，此時料液比為1∶6；隨著料液比的增大，底物濃度和酶濃度開始慢慢稀釋，提取率下降。

3.2.4 酶解pH對芹菜籽油提取率的影響

固定酶解溫度為55℃，酶解時間為4h，料液比為1∶6的條件下，只改變酶解pH，測定芹菜籽油提取率的結果如圖4。

圖4 酶解pH對芹菜籽油提取率的影響

由圖4表明，芹菜籽油提取率隨著酶解pH的升高而迅速增加，在pH 6.2時達到最高，芹菜籽油提取率為32.80%。但當pH超過6.2時，提取率隨pH的升高而下降，這可能與中性蛋白酶和中溫α淀粉酶的最適酶解pH有關，當酶解pH偏離其最適pH時不利于中性蛋白酶和中溫α淀粉酶作用，酶活下降嚴重，細胞壁的破壞效果減弱不利于芹菜籽油的萃取。

3.2.5 芹菜籽油提取工藝條件的優化

根據上述單因素的實驗研究結果發現，料液比（A）、酶用量（B）和pH值（C）對芹菜籽油得率影響較大。因此，采用三因素三水平的正交試驗方法對工藝條件進行優化，以芹菜籽油得率為評價指標，設計方案見表1。按表1對進行實驗，各處理做3次平行，測定芹菜籽油得率，取平均值，并作極差和方差分析，結果見表2、3。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗設計及結果

表3 正交試驗結果方差分析表

F0.05（2，2）=19。

從表3比較3個因素的極差R值，RB＞RC＞RA，即酶用量＞pH值＞液料比，說明因素B對指標的影響最大。根據K值實驗結果可見，最佳工藝組合為A2B3C2，即液固比6∶1，pH值6.2，酶用量1.70%。

3.2.6 芹菜籽油收集

實驗以傾倒料液時料與液的分離難易程度，加水振蕩料層后傾倒時物料洗出程度，乳化物層厚度及清油層厚度為評價標準，研究離心時轉速及時間對提油率的影響。

表4 芹菜籽油的理化性質

表5 芹菜籽油化學成分分析結果

當轉速在3 500～4 500rpm時，選擇離心時間為45min，料與液的分離效果不明顯，傾倒時料與液難以分離，且上層油層乳化現象嚴重，油層顏色呈蛋黃色，清油層薄之不可見。

圖5 芹菜籽油總離子流圖

當離心轉速為7 000～8 500rpm時，選擇離心時間為15min，離心即能達到料與液分離的目的，溶液可輕易的傾倒出離心杯，清油層與乳化物層界限明顯，加水振蕩物料層有少量或極少物料被洗脫，說明離心后物料厚實沉積在離心杯底部，達到分離的目的。

離心后將收集到的芹菜籽油過無水硫酸鈉層，即得芹菜籽油，芹菜籽油總得率為4.10%，芹菜籽油提取率為45.60%。

3.3 芹菜籽油的理化性質

芹菜籽油呈棕綠色，澄清透明，室溫下流動性良好，具有強烈持久辛香、藥草香氣。

相關理化性質以及與大豆原油、花生原油、芝麻原油的比較結果見表4。由表4可以看出，與其他3種植物原油相比，芹菜籽的折光指數與芝麻原油接近，高于大豆原油和花生原油；過氧化值與酸值均達到標準；皂化值均比大豆原油、花生原油和芝麻原油低，因此含有較多的不皂化物；碘值低于大豆原油和芝麻原油，與花生原油接近。綜上分析比較，如果對芹菜籽油進行合理精制達到國家食用植物油脂相關標準后，預計可以成為一種植物油脂的新來源。

3.4 芹菜籽油化學成分GC-MS分析

取適量芹菜籽油，以無分流方式進樣，進行GC-MS分析，得總離子流圖，共分離出26個化學成分，結果見圖5，經GC-MS計算機的NIST庫自動檢索，并查閱相關文獻與標準圖譜對照分析，鑒定了23種化學成分，用面積歸一法計算出其相對含量，結果見表5。

從表5可以看出，用GC-MS從芹菜籽油中共鑒定出23種化合物，檢出率達99.94%，其中酯類物質占86.55%；含量最高的為反式-9-十八烯酸甲酯（52.79%），其次分別為9,12-十八烷二烯酸甲酯（亞油酸）（17.26%），亞油酸是人體必需脂肪酸，對人體有多種生理功能，十六烷酸甲酯（9.68%），4-甲基苯酚（6.19%）等，都是該芹菜籽油的主要成分。

4 結論

根據實驗結果，確定最佳工藝條件為：選擇中性蛋白酶和中溫α淀粉酶（1∶1比例）復合使用，酶添加量為1.70%，料液比1∶6，pH為6.2，55℃酶解4h，在此工藝條件下，芹菜籽油的提取率45.60%，芹菜籽油總得率為4.10%。由此試驗可以看出，可能是由于芹菜籽油揮發油含量高。用GC-MS從芹菜籽油中共鑒定出23種化合物，檢出率達98.30%，其中酯類物質占86.55%；含量最高的為反式-9-十八烯酸甲酯（52.79%），其次為9,12-十八烷二烯酸甲酯（亞油酸）（17.26%）。纖維素酶與α-淀粉酶復合使用工藝對芹菜籽油進行富集與分離工藝具有創新性突出的特點。

[1]王文寶,李杰,劉彥麟,等.芹菜籽粉對高脂膳食大鼠血脂及肝功能的影響[J].吉林醫藥學院學報,2012,6(33):143-145.

[2]徐成,沈志斌,丁倩,等.芹菜籽油抗腦缺血作用的研究[J].中成藥,2007,29(6):44-45.

[3]劉輝.芹菜籽油的提取純化及降血脂功能研究[D].沈陽:沈陽農業大學,2009:15-19.

[4]國家標準化管理委員會.GB/T 5527-2010 植物油脂檢驗折光指數測定法[S].北京:遼寧省糧油檢驗監測所等,2010.

[5]薛雅琳,張穎,劉建濤.GB/T 5538-2005 動植物油脂 過氧化值測定[S].北京:南京經濟學院,2005.

[6]薛雅琳,張穎,咼琴.GB/T 5530-2005 動植物油脂 酸值和酸度測定[S].北京:國糧局西安油脂科研院,2005.

[7]張世宏,何東平,黃小平.GB/T 5534-2008 動植物油脂 皂化值的測定[S].北京:武漢工業學院、國家糧食儲備局武漢科學研究設計院,2008.

[8]劉良忠,何東平,張世宏.GB/T 5532-2008 動植物油脂 碘值的測定[S].北京:武漢工業學院,2008.

Study on the Extraction of Celery Seed Oil by Complex Enzyme Method

Xu Guo-liang*, Li Xiong-hui, Yuan Ju-ru, Hu Ju-wu, Tu Zhao-xiu
(Jiangxi Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330096)

Celery seeds as raw material, composite enzymatic extraction conditions of celery seed oil was optimized by single factor method and orthogonal design method and on the chemical composition of celery seed oil from the GCMS analysis the experimental results show that the selection of neutral protease and medium temperature amylase (1 ∶1) composite, enzyme dosage is 1.7%, the material liquid ratio 1 ∶ 6, pH 6.2, 55 ℃ enzymatic 4h, under this condition, celery seed oil extraction rate was 45.6%, total yield is 4.1% celery seed oil.From celery seed oil were identified 23 kinds of compounds with GC-MS.

Celery seed; Celery seed oil; Compound enzyme; Cellulase; Enzyme extraction

TS264.4

A

2096-0387（2016）01-0015-05

國家自然科學基金項目（項目編號31260400）。

徐國良（1964-），男，本科，副研究員，研究方向：天然產物。