榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β、NO及氧自由基代謝的影響*

陳小平，王志旺，劉彩民△，妥海燕，王瑞瓊靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院，甘肅 靖遠(yuǎn) 730600；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β、NO及氧自由基代謝的影響*

陳小平1，王志旺2，劉彩民1△，妥海燕2，王瑞瓊2
1靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院，甘肅 靖遠(yuǎn) 730600；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

目的：探討榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠白介素1β（IL-1β）、一氧化氮（NO）及氧自由基代謝的影響。方法：采用注射4%木瓜蛋白酶復(fù)制骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，通過觀測膝關(guān)節(jié)功能，血清IL-1β、關(guān)節(jié)液NO與NOS、關(guān)節(jié)組織氧自由基代謝等指標(biāo)，探討榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用及作用機制。結(jié)果：榮骨定痛膏可明顯減小骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜腫脹厚度，擴大膝關(guān)節(jié)的活動范圍，降低血清IL-1β、關(guān)節(jié)液NO 及NOS的水平，提高滑膜組織中SOD的活性而降低MDA的含量。結(jié)論：榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠具有一定治療作用，抑制IL-1β誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生而發(fā)揮抗氧化、抑制滑膜細(xì)胞的凋亡是其治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制之一。

骨性關(guān)節(jié)炎；白介素1β；一氧化氮；抗氧化系統(tǒng)；榮骨定痛膏

骨性關(guān)節(jié)炎是一種慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)功能與結(jié)構(gòu)退行性疾病，屬臨床常見病，目前尚缺乏有效根治措施，作為非手術(shù)療法的中醫(yī)藥在治療慢性退行性疾病過程中顯示出獨特的療效而日益受到重視［1-2］。骨性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”范疇，多因腎氣虧虛、關(guān)節(jié)失養(yǎng)，復(fù)受風(fēng)寒濕邪，氣血痹阻，經(jīng)絡(luò)不暢而發(fā)，治療應(yīng)補益肝腎、活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、勝濕止痛。基于上述中醫(yī)藥理論形成的榮骨定痛膏在臨床上取得了較好療效。本研究通過復(fù)制骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，考察榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與功能、IL-1β、NO及氧自由基代謝的影響，探討榮骨定痛膏防治骨性關(guān)節(jié)炎的作用及機制，為臨床用藥提供理論依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1　材料與方法

1.1藥物榮骨定痛膏(每毫升軟膏劑含原生藥1.5 g，靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院提供，批號：20140610)；鹽酸氨基葡萄糖膠囊(浙江誠意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20130603)。

1.2試劑木瓜蛋白酶(美國Sigma公司生產(chǎn)，批號：118K1461)；IL-1β試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所提供，批號：20140608)；NO、NOS、SOD、MDA與考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所提供，批號：20140520、20140520、20140501、20140512與20140601)。其余試劑為分析純。

1.3動物SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(甘)2004-0006，SPF級實驗室許可證號：SYXK(甘)2011-0001。

1.4儀器Cole-Parmer LabGEN125勻漿機(北京中科科爾儀器有限公司)；TGL-16G高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn))；N-5600PC型METASH可見分光光度計(上海元析儀器有限公司生產(chǎn))；HH-S型恒溫水浴鍋(金壇市正基儀器有限公司生產(chǎn))；BS1103 sar torius電子天平(北京賽多里斯有限公司)。

1.5方法

1.5.1分組、造模及給藥取SD雄性大鼠48只，按體質(zhì)量隨機分為6組，即正常對照組，模型對照組，氨基葡萄糖組(90mg/kg)，榮骨定痛膏高、中、低劑量組(120、60、30mg/d)各8只。各組大鼠膝關(guān)節(jié)及周圍皮膚脫毛，參照相關(guān)實驗方法［3-4］，在造模的第1、3、7天，將4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液50μL注入大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，正常對照組注射等量生理鹽水。造模的同時給藥，即在大鼠膝關(guān)節(jié)涂抹不同濃度(1.500、0.750、0.375 g/mL)榮骨定痛膏40μL，氨基葡萄糖組灌胃0.9%氨基葡萄糖5mL/kg，正常對照組與模型對照組膝關(guān)節(jié)涂抹蒸餾水，2次/d，連續(xù)5周。

1.5.2取材、檢測指標(biāo)末次涂藥2小時后，用水合氯醛麻醉大鼠，在室溫下由同一人測量被動膝關(guān)節(jié)活動度，即于膝關(guān)節(jié)等距離處垂直施以相等的力量伸展后回縮大鼠左、右膝關(guān)節(jié)，用量角器測量其伸展至回縮的角度并計算平均值［5］。股靜脈采血，待血液自然凝固2小時后，分離血清，按試劑盒說明書測定血清IL-1β的水平。取血后，向大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射生理鹽水，0.1mL/次，反復(fù)抽吸后，抽取關(guān)節(jié)灌洗液，每個關(guān)節(jié)抽洗3次，將關(guān)節(jié)灌洗液2 000 r/min離心10分鐘，取上清液測定NO、NOS的水平。處死大鼠，切取完整膝關(guān)節(jié)，立即打開關(guān)節(jié)腔，刮取關(guān)節(jié)面上的滑膜組織，用螺旋測微器于固定位置測定關(guān)節(jié)滑膜厚度［5］，之后立即置冰浴中的組織勻漿器內(nèi)，加入冰生理鹽水，制成2%滑膜組織勻漿，在4℃下4 000 r/min離心10分鐘，取上清液，按試劑盒說明書測定SOD的活性及MDA的含量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)活動范圍、關(guān)節(jié)滑膜厚度的影響大鼠膝關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白酶35天后膝關(guān)節(jié)活動范圍縮窄，關(guān)節(jié)滑膜腫脹厚度增加，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)榮骨定痛膏治療后，膝關(guān)節(jié)的活動范圍擴大，關(guān)節(jié)滑膜腫脹厚度減小，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與榮骨定痛膏低劑量組比較，榮骨定痛膏高劑量組的治療作用更強(P＜0.05)，見表1。

表1　榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)活動范圍、關(guān)節(jié)滑膜厚度的影響χ±s）

表1　榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)活動范圍、關(guān)節(jié)滑膜厚度的影響χ±s）

注：與正常對照組比較，※※表示P＜0.01；與模型對照組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與榮骨定痛膏低劑量組比較，▲表示P＜0.05。

組別　只數(shù)　劑量　關(guān)節(jié)活動范圍/°　關(guān)節(jié)滑膜厚度/mm正常對照組　8　-　158.86±7.79　0.25±0.04模型對照組　8　-　103.19±12.58※※　0.39±0.07※※氨基葡萄糖組　8　90mg/kg　127.25±13.13△△　0.28±0.05△△榮骨定痛膏高劑量組　8　120mg/d　133.03±14.12△△▲　0.30±0.05△▲榮骨定痛膏中劑量組　8　60mg/d　121.69±13.00△　0.32±0.06△榮骨定痛膏低劑量組　8　30mg/d　117.34±12.93△　0.36±0.06

2.2榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影響復(fù)制骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠35天，血清IL-1β水平與關(guān)節(jié)灌洗液NO與NOS的水平升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；經(jīng)榮骨定痛膏治療后，IL-1β、NO與NOS的水平有所下降，其中榮骨定痛膏高劑量組及中劑量組與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.3榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織中抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的影響骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中SOD的活性降低，MDA的含量增加，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。榮骨定痛膏治療35天后，滑膜組織中SOD的活性顯著升高，MDA的含量下降，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與榮骨定痛膏低劑量組比較，高、中劑量組的作用更強(P＜0.01)，見表3。

表2　榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影響χ±s）

表2　榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影響χ±s）

注：與正常對照組比較，※※表示P＜0.01；與模型對照組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01。

組別　只數(shù)　劑量　IL-1β/（μg·L-1）　NO/（μmol·L-1）　NOS/（U·mL-1）正常對照組　8　-　0.093±0.015　6.16±1.34　2.33±0.41模型對照組　8　-　0.269±0.036※※　9.87±2.08※※　3.85±0.74※※氨基葡萄糖組　8　90mg/kg　0.241±0.035　7.98±1.70　3.41±0.69榮骨定痛膏高劑量組　8　120mg/d　0.208±0.033△△　7.18±1.51△　2.83±0.60△△榮骨定痛膏中劑量組　8　60mg/d　0.225±0.034△　7.72±1.70△　3.08±0.61△榮骨定痛膏低劑量組　8　30mg/d　0.231±0.035　8.36±1.73　3.45±0.68

表3　榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織中抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的影響χ±s）

表3　榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織中抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的影響χ±s）

注：與正常對照組比較，※※表示P＜0.01；與模型對照組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與榮骨定痛膏低劑量組比較，▲▲表示P＜0.01。

組別　只數(shù)　劑量　SOD/（U·mg-1）　MDA/（nmoL·mg-1）正常對照組　8　-　96.22±10.35　20.95±4.08模型對照組　8　-　64.87±7.97※※　102.58±16.75※※氨基葡萄糖組　8　90mg/kg　75.36±8.15△　83.70±14.93△榮骨定痛膏高劑量組　8　120mg/d　122.76±15.48△△▲▲　34.44±9.31△△▲▲榮骨定痛膏中劑量組　8　60mg/d　107.41±12.77△△▲▲　51.49±11.44△△▲▲榮骨定痛膏低劑量組　8　30mg/d　79.80±8.36△△　81.00±14.85△

3　討論

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoar thritis，OA)也稱骨關(guān)節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)炎等，好發(fā)于膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱及手指等部位，是一種多發(fā)于老年人的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病。隨著社會進(jìn)入老齡化，該病發(fā)病率逐年增加。據(jù)統(tǒng)計，美、英等西歐國家有5%～10%的成年人患有骨性關(guān)節(jié)炎，此病與心血管疾病、創(chuàng)傷并列前3位，每年需手術(shù)治療者達(dá)幾十萬人，由此產(chǎn)生的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)對社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展有較大影響［6］。隨著我國社會人口結(jié)構(gòu)的迅速老齡化，本病不但是公共衛(wèi)生問題，而且也成為社會問題，日益引起人們的重視，因此，防治OA已成為各國骨科學(xué)界的重要課題。OA的發(fā)病機制復(fù)雜，但其基本病理變化為關(guān)節(jié)軟骨的退行性變與關(guān)節(jié)的增生性改變(特別是軟骨周圍及滑膜處)。目前臨床尚缺乏有效的根治措施，治療目的為緩解關(guān)節(jié)疼痛，改善關(guān)節(jié)功能并促進(jìn)重建受損的軟骨及骨結(jié)構(gòu)；由于手術(shù)治療缺乏確切有效的臨床治療方案，使得病程明顯延長，作為非手術(shù)療法的中醫(yī)藥日益受到人們的重視［7］。

中醫(yī)理論認(rèn)為，OA多因腎氣虧虛，關(guān)節(jié)失養(yǎng)，局部勞損閉阻；復(fù)感風(fēng)寒濕邪，經(jīng)絡(luò)不暢，氣血痹阻，關(guān)節(jié)寒凝、痰阻，不通則痛，故治療應(yīng)補益肝腎、活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、勝濕止痛［8-9］。在此基礎(chǔ)上擬定的榮骨定痛膏由山茱萸、杜仲、牛膝、當(dāng)歸、秦艽、獨活、川烏等40余味中藥組成，臨床應(yīng)用效果良好。本動物實驗結(jié)果顯示，榮骨定痛膏可明顯擴大病變關(guān)節(jié)的活動范圍，減小滑膜腫脹厚度，改善骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)與功能。

IL-1是最早也是最重要的骨性關(guān)節(jié)炎促炎因子，成熟的IL-1β是由IL-1轉(zhuǎn)換酶裂解IL-1β前體而來［10］。在正常關(guān)節(jié)中IL-1含量極少且主要是IL-1β，在骨性關(guān)節(jié)炎中，IL-1特別是IL-1β的含量異常升高。骨性關(guān)節(jié)炎中IL-1影響軟骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)其凋亡，打破軟骨基質(zhì)合成與代謝間的平衡，使滑膜炎性病變，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞。在關(guān)節(jié)軟骨中，軟骨細(xì)胞對于保持關(guān)節(jié)軟骨功能和結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要作用，IL-1參與關(guān)節(jié)軟骨破壞的起始和進(jìn)展：一方面，IL-1殺傷線粒體呼吸鏈，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，軟骨細(xì)胞的能量供應(yīng)減少，使軟骨細(xì)胞活性下降［11］；另一方面，IL-1激活并提高誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的活性，使NO合成增加［12］，而一氧化氮可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分解代謝，加速軟骨細(xì)胞的凋亡［13］。同時，一氧化氮屬于活性氮自由基，可引起活性氧的產(chǎn)生而加速脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對DNA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及膠原合成酶造成損傷，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能紊亂［14］。骨性關(guān)節(jié)炎時滑膜常出現(xiàn)異常病變，IL-1通過影響NO控制線粒體功能，影響細(xì)胞周期蛋白而損害骨性關(guān)節(jié)炎中的滑膜細(xì)胞［15］。本實驗證實榮骨定痛膏在治療骨性關(guān)節(jié)炎的過程中可降低IL-1β、NO及NOS水平，提高滑膜組織中SOD的活性而降低MDA的含量。

綜上所述，榮骨定痛膏對骨性關(guān)節(jié)炎有一定治療作用，緩解IL-1、NO及氧自由基代謝的異常變化是其作用機制之一。

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The In fluence of RongGu DingTong Ointm ents on IL-1β，NO and Oxygen Free RadicalMetabolism ofOA Rats

CHEN Xiaoping1，WANG Zhiwang2，LIU Caimin1△，TUO Haiyan2，WANG Ruiqiong2
1 Jingyuan County TCM Hospital，Jingyuan 730600，China；2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

Objective：To discuss the effectsof RongGu DingTong ointmenton IL-1β，NO and oxygen free radicalmetabolism of the ratsw ith osteoarthritis（OA）.Methods：OA ratmodelwasestablished by injecting 4%papain，therapeutic effects and itsmechanism of RongGu DingTong ointmentwere studied by observing knee joint function，the contentsof IL-1β，NO and NOS，and oxygen free radicalmetabolism in joint tissue.Results：RongGu DingTong ointmentcould reduce the thicknessof jointsynovialswelling of OA rats，increase the range ofmotion of knee joint，decrease the levels of IL-1β，NO and NOS，and improving SOD activity in synovial tissue therefore to decrease the contents of MDA.Conclusion：RongGu DingTong ointment is effective in treating OA rats to a certain degrees，one of itsmechanisms is inhibiting NO generation induced by IL-1β，hence to develop antioxidant functions and inhibit theapoptosisof synovialcells.

osteoarthritis；IL-1β；NO；antioxidantsystem；RongGu DingTong ointment

R684.3

A

1004-6852（2016）07-0023-04

2015-06-25

甘肅省中醫(yī)藥管理局科研課題基金項目（編號GZK-2013-38）。

陳小平（1971—），男，副主任醫(yī)師。研究方向：風(fēng)濕病、骨病的中醫(yī)藥研究與治療。

劉彩民（1956—），男，副主任醫(yī)師。研究方向：風(fēng)濕病、骨病的中醫(yī)藥研究與治療。