基于代謝組學技術研究澤瀉對高脂血癥大鼠防治的生物化學作用機制

苗　華

(西北大學 體育教研部, 陜西 西安　710069)

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·生命科學·

基于代謝組學技術研究澤瀉對高脂血癥大鼠防治的生物化學作用機制

苗華

(西北大學 體育教研部, 陜西 西安710069)

利用代謝組學方法鑒定澤瀉對高脂飼料誘導的高脂血癥治療的尿液生物標示物和闡明生物化學作用機制。超高壓液相色譜和質譜聯用測定對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組尿液,采用偏最小二乘判別分析法研究對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組之間的代謝物譜差異,鑒定了14個生物標示物,高脂血癥模型組高脂飼料上調了大鼠尿液硬脂酸酰胺、油酸酰胺、3-甲基尿苷、十六烷酰胺、吲哚-3-甲酸和肌酐,同時下調了二十四碳六烯酸、3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺、尿酸、苯丙氨酸、左旋肉堿和甲基肌苷。澤瀉提取物逆轉了這些異常上調和下調的生物標示物。澤瀉提取物改善了由高脂飼料造成的異常的脂肪酸代謝、氨基酸代謝和嘌呤代謝。代謝組學技術能夠應用于高脂血癥及其澤瀉對其治療的生物化學作用研究。

高脂血癥;代謝組學;澤瀉;超高壓液相色譜;質譜;脂肪酸代謝;氨基酸代謝;嘌呤代謝

隨著生活節奏的加快和飲食結構的改變,高脂血癥已成為影響人類健康的主要疾病之一。高脂血癥是高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥的統稱。高脂血癥是指由各種原因導致的血漿中膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇過高和高密度脂蛋白膽固醇過低等脂代謝異常。高脂血癥容易導致動脈粥樣硬化(頭部的腦動脈、心臟的冠狀動脈、腎臟動脈等阻塞),是心腦血管疾病的病理學基礎。隨著中藥對高脂血癥治療研究進步,中藥在治療高脂血癥和防治心腦血管相關疾病方面顯現出獨特的優勢,因其療效顯著、持續且副作用小而備受關注,具有廣闊的應用前景。我們以前的研究顯示大黃、茯苓和茯苓皮對高脂飼料誘導的高脂血癥大鼠有較好的治療作用[1-4],中藥澤瀉性寒,味甘、淡,歸腎、膀胱經。具有利水滲濕、化濁降脂、泄熱通淋等功效,可用于小便不利、熱淋澀痛、水腫脹滿等癥,藥理研究證明澤瀉具有利尿、抑制動脈粥樣硬化和抗腎結石的活性[5-7],同時還有保肝、抗炎、降低血壓以及抗高血脂等作用[7]。代謝組學是通過考察生物體系受刺激或擾動前后(如將某個特定的基因變異或環境變化后)代謝產物圖譜及其動態變化研究生物體系的代謝網絡的一種技術。代謝組學已被廣泛應用于高脂血癥診斷、藥物療效與藥物作用機理等方面[8-10]。我們以前的初步研究顯示澤瀉對高脂血癥大鼠有較好的防治作用[11],本文利用代謝組學技術進一步研究澤瀉提取物防治高脂血癥的生物化學作用機制。

1　實驗對象與方法

1.1澤瀉乙醇提取物

澤瀉樣品經過干燥、粉碎后,根據報道方法,采用95%乙醇制備澤瀉乙醇提取物[11]。

1.2實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠24只,隨機分成3組,對照組:正常食料喂養;高脂血癥模型組:高脂飼料喂養;澤瀉提取物治療組:高脂飼料喂養同時灌胃澤瀉乙醇提取物10g/(kg·d-1),根據以前我們報道的給藥和治療方案獲得大鼠的尿液[11]。

1.3代謝組學方法

在完成在美國Waters AcquityTM液相色譜儀和XevoTMG2 QTof質譜儀測得尿液。超高壓液相色譜和質譜條件參考我們報道的方法[11]。

1.4數據分析

對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿液樣品經色譜分離、質譜采集后生成初始結果RAW文件,經Markerlynx XS 軟件進行色譜峰自動識別和峰匹配,產生含保留時間、質荷比及響應強度信息的代謝產物列表;將該矩陣列表導入Markerlynx軟件進行偏最小二乘法-判別分析和載荷圖分析。所有數據用平均值±標準偏差表示,兩組間差異比較,采用t檢驗,P<0.05表示統計學上存在顯著性。

2　結果和討論

2.1正常組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿樣的代謝組學分析

在正離子模式下,采用UPLC-MS方法采集大鼠對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組尿樣的數據。圖1為正離子模式下典型的大鼠對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組尿樣的BPI色譜圖。其顯示對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組存在一定的差別,MakerLyxn軟件對所采集的對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組尿樣的數據進行峰提取和峰匹配,共識別出3 160個離子信息。

2.2對照組、高脂血癥模型組和澤瀉提取物治療組大鼠尿樣的多元統計分析

為了更好地了解對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組內源性代謝產物的變化,在正離子模式下,我們采用PLS-DA分析方法對對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿樣代謝譜數據進行多元統計分析。對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿液的PLS-DA分析結果顯示對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組明顯的分開,對照組與高脂血癥模型組距離較遠,通過澤瀉治療后的高脂血癥模型組明顯的接近對照組,證明澤瀉對高脂血癥有明顯的治療作用(圖2A)。

圖1　正常對照組(A)、高脂血癥模型組(B)和澤瀉提取物治療組(C)尿液的BPI色譜圖Fig.1　Urinary BPI chromatograms obtained from the control group (A) and hyperlipidemia group (B) and Alisma orientale treatment group (C)

圖2　對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組尿液的PLS-DA投影圖(A)和作為選擇生物標示物的PLS-DA 載荷投影圖(B)Fig.2　PLS-DA score plot based on the urinary metabolic profiling of the control group and hyperlipidemia group and Alisma orientale treatment group (A) and PLS-DA loading plot used in biomarkers selection (B)

2. 3生物標示物結構鑒定

鑒定內源性代謝產物是代謝組學研究的重要部分。基于UPLC-MS的代謝組學方法主要通過精確質量數、質譜碎片信息、同位素分布和標準品對照確定代謝產物的結構[12-14]。表1顯示了對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿液中鑒定的14個生物標示物、變化趨勢及其代謝途徑。鑒定的代謝產物主要包括脂肪酸、氨基酸、3-甲基尿苷、吲哚-3-甲酸、肌酐、多巴胺、尿酸等,這些內源性代謝產物的異常變化表明了在高脂血癥大鼠中高脂飼料干擾了脂肪酸代謝、氨基酸代謝和嘌呤代謝等,這些結果和我們以前的研究一致[15]。澤瀉提取物對這些紊亂的代謝產物起到不同程度的逆轉作用,改善了異常的脂肪酸、氨基酸和嘌呤代謝途徑。

表1　對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿液中鑒定的14個生物標示物、變化趨勢及其代謝途徑

注:a對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組的鑒定的代謝產物升高(↑)或降低(↓),高脂血癥模型組與對照組比較:*P<0.05;**P<0.01;澤瀉提取物治療組與高脂血癥模型組比較:#P<0.05,##P<0.01

2.4生物標示物相關系數分析

為了研究澤瀉提取物對高脂血癥的防治效果,我們應用相關系數分析研究鑒定的生物標示物和對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組的關系。圖3顯示了鑒定的14個代謝產物在對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組的變化趨勢。變化趨勢朝上的是和對應組正相關,反之,朝下的是和對應組負相關。生物標示物3，7，12，13和14是和對照組正相關;生物標示物1，2，4，5，6，8，9和11是和對照組負相關,這些結果證明14個代謝產物正常的代謝變化趨勢。生物標示物1，2，3，4，5，6，8和9是和高脂血癥模型組正相關;生物標示物7，10，11，12，13和14是和高脂血癥模型組負相關,這些結果證明高脂飼料造成了高脂血癥,高脂血癥和這14個生物標示物的異常代謝有關。在澤瀉提取物治療組生物標示物1，2，3，4，5，6，8，9，12和14是和澤瀉提取物治療組正相關;生物標示物7，10，11和13是和澤瀉提取物治療組負相關,高脂血癥組大鼠的生物標示物經過澤瀉提取物治療恢復到了對照組的生物標示物的變化趨勢,澤瀉提取物治療組生物標示物的整體變化趨勢和對照組的變化趨勢一致,表明澤瀉提取物對高脂血癥大鼠有較好的改善作用。

圖3　對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組的PLS-DA相關性系數分析Fig.3　Correlation coefficient analysis of PLS-DA from control and hyperlipidemia and Alisma orientale treatment groups

2.5生物標示物生物化學代謝途徑分析

高脂血癥模型組高脂飼料上調了大鼠尿液硬脂酸酰胺、油酸酰胺、3-甲基尿苷、十六烷酰胺、吲哚-3-甲酸和肌酐,同時下調了二十四碳六烯酸、3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺、尿酸、苯丙氨酸、左旋肉堿和甲基肌苷。生物標示物硬脂酸酰胺、油酸酰胺、十六烷酰胺和二十四碳六烯酸的代謝異常表明高脂飼料導致大鼠脂肪酸代謝紊亂。生物標示物油酸酰胺、硬脂酸酰胺和十六烷酰胺是脂肪酰胺水解酶的底物,脂肪酰胺水解酶的生物活性影響水解酶的相對比率[16]。因此在澤瀉提取物治療組下調硬脂酸酰胺、油酸酰胺和十六烷酰胺可能造成上調的脂肪酰胺水解酶。二十四碳六烯酸是以亞麻酸為底物經過碳鏈延伸和去不飽和度化學反應的產物,二十四碳六烯酸再經過C24:6n-3到C22:6n-3的脂肪酸的β-氧化反應產生二十二碳六烯酸。降低的二十四碳六烯酸與異常的脂肪酸β-氧化有關,然而澤瀉提取物改善了高脂血癥中存在的脂肪酸β-氧化異常的發生。

生物標示物3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺和苯丙氨酸的異常表明高脂血癥大鼠氨基酸的代謝的紊亂。生物標示物3-氧-甲基多巴、甲基多巴和苯丙氨酸在動脈粥樣硬化有重要作用[17]。高脂血癥中下調的3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺和苯丙氨酸和澤瀉提取物治療上調這些代謝產物證明澤瀉對高脂血癥有較好的治療作用。

生物標示物尿酸和甲基肌苷的異常表明高脂血癥大鼠尿液嘌呤代謝的紊亂。尿酸是嘌呤代謝的最終氧化產物,黃嘌呤氧化酶氧化黃嘌呤到尿酸。生物標示物肌酐的異常表明高脂血癥大鼠肌酸或能量代謝的紊亂。肌酐是肌肉在人體內代謝的產物,肌酐是檢測腎功能的生物標示物,增加的肌酐標志腎臟的代謝異常[18-19]。因此，增加的肌酐可能意味著在高脂血癥大鼠腎功能受到影響。

3　結　論

采用高脂飼料誘導的高脂血癥大鼠研究澤瀉對其治療的生物標示物和生物化學作用機制,研究顯示澤瀉改善了高脂血癥中紊亂的脂肪酸代謝、氨基酸代謝和嘌呤代謝。代謝組學技術能夠應用于高脂血癥及澤瀉對其的治療生物化學作用機制研究。

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(編輯陳鐿文)

The identified biomarkers and biochemical mechanism of therapeutic effect ofAlismaorientaleon diet-induced hyperlipidemia rats

MIAO Hua

(Department of Physicsl Edneation, Northwest University, Xi′an 710069, China)

The identified biomarkers and biochemical mechanism of therapeutic effect ofAlismaorientaleon diet-induced hyperlipidemia rats was studied by metabolomic approach. Urinary from control, hyperlipidemia andAlismaorientaletreatment groups was analyzed by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry. Acquired data were subjected to PLS-DA for differentiating the control, hyperlipidemia andAlismaorientaletreatment groups. Biomarkers were identified by PLS-DA. Fourteen metabolites were identified as potential biomarkers. Compared with control rats, up-regulated octadecanamide, oleamide, 3-methyluridine, palmitic amide, indole-3-carboxylic acid and creatinine as well as down-regulated tetracosahexaenoic acid, 3-O-methyldopa, 3-indole carboxylic acid glucuronide, dopamine, uric acid, phenylalanine, L-carnitine and methylinosine were observed in diet-induced hyperlipidemia group. The up-regulation and down-regulation of metabolites were reversed by treatment withAlismaorientale. The perturbations of fatty acid metabolism, amino acid metabolism and purine metabolism were observed in diet-induced hyperlipidemia rats. The study shows that metabonomics could be applied to investigation of identified biomarkers and biochemical mechanism of therapeutic effect ofAlismaorientaleon diet-induced hyperlipidemia rats.

hyperlipidemia; metabolomics;Alismaorientale; ultra-performance liquid chromatography; mass spectrometry; fatty acid metabolism; amino acid metabolism; purine metabolism

2015-12-04

國家自然科學基金資助項目(81202909，81274025， 81001622)；西北大學本科教學質量與教學改革工程基金資助項目(JX13037)

苗華，女，副教授，河南南陽人，從事中藥藥理學和代謝組學研究。

R285.5

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-03-017