人工合成靶序列快速構建多靶標RNAi表達載體

張秀春，吳坤鑫，趙平娟，劉志昕（中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 海口 571101）

人工合成靶序列快速構建多靶標RNAi表達載體

張秀春，吳坤鑫，趙平娟，劉志昕
（中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 海口 571101）

番木瓜環斑病毒（PRSV）正引起番木瓜毀滅性嚴重病害，番木瓜葉扭曲花葉病毒（PLDMV）也在威脅著目前轉基因番木瓜的推廣和應用。通過人工合成包含PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個保守區域的靶序列作為模板，擴增兩條長短不同但大部分重疊的靶序列，并通過引物設計時添加的特定酶切位點兩個靶序列反向連接，形成以長靶序列的5’一部分序列作為發夾結構的環，不需要另外插入內含子序列的反向重復發夾結構的RNAi表達載體pPTN-LS。該方法構建的RNAi表達載體，不僅具有快速、穩定性高等優點，還能同時靶標PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個保守區域的靶序列，能有效提高沉默效率，為利用RNAi技術培育廣譜、高效、穩定且安全性高，同時抗PRSV和PLDMV病毒病的轉基因番木瓜新種質的奠定基礎。

人工合成靶序列；番木瓜環斑病毒；番木瓜葉扭曲花葉病毒；RNAi表達載體

張秀春，吳坤鑫，趙平娟，等. 人工合成靶序列快速構建多靶標RNAi表達載體［J］.廣東農業科學，2016，43（7）：81-86.

番木瓜（Carica papaya L.）主要分布于熱帶和亞熱帶地區，是人們喜愛的果蔬兼藥用的熱帶水果，在我國南方有“萬壽果”和“嶺南佳果”的美譽。番木瓜環斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）嚴重影響著番木瓜產業的健康發展［1］。隨著基因工程抗病分子育種的發展，國內外研究人員先后將PRSV外殼 蛋白、復制酶等基因導入番木瓜獲得不同的抗PRSV的轉基因株系［2-4］。由于轉基因番木瓜對病毒的抗性有株系專化性，但研究結果發現由于各地區PRSV病毒株存在差異，導致一個地區的轉基因植物在另一個地區種植表現出的抗病能力減弱，甚至抗性喪失，因而限制了抗PRSV轉基因番木瓜的推廣和應用。此外，番木瓜畸形花葉病毒病（Papaya leaf-distortion mosaic virus，PLDMV）是另一種嚴重危害番木瓜的病原，最早出現在日本，給當地的番木瓜種植業造成很大的損失［5］，20世紀90年代在巴西、臺灣等地也有發現［6-7］。抗PRSV轉基因番木瓜品種不具備對PLDMV的抗性，雖然2001年對我國華南地區番木瓜PLDMV發病情況的調查表明尚未發現有相關病例，但2013年楊勇等［8］、張雨良等［9］相繼報道在海南發現該病毒，對番木瓜生產構成潛在威脅。因此，培育穩定、高抗、譜抗且安全性好的新品種對我國番木瓜產業發展具有重要意義。

RNA沉默是利用siRNA指導同源RNA降解或抑制其翻譯或修飾同源DNA抑制其轉錄。由于不需要產生新的蛋白，因此應用RNA沉默技術在育種中具有高效、特異和安全等特點。另外，由于反向重復序列片段小，有利于構建含多個病毒基因的嵌合基因，獲得同時抗多種病毒的轉基因植株。RNA沉默技術的應用，為我們提供了一條更為有效、安全的抗病毒新策略。目前利用RNA沉默技術已成功獲得高抗、穩定且安全性高的抗病毒轉基因大豆、馬鈴薯、番木瓜等作物［10-11］。本研究通過比對GenBank中危害番木瓜的兩種主要病毒PRSV和PLDMV的多條基因組全長序列，人工合成包含PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個保守區域的靶序列。以人工合成靶序列為模板，設計擴增長短不同但大部分重疊的兩對引物，最后通過引物設計時添加的特定酶切位點使長短不同的兩個靶序列反向連接，形成以長靶序列的5’一部分序列作為發夾結構的環，不需要另外插入內含子序列的反向重復發夾結構的RNAi表達載體。該方法構建RNAi表達載體，不僅具有快速、穩定性高等優點，而且較短的序列就能包含更多的保守序列，具有反向重復發夾結構RNAi載體產生dsRNA的效率更高，并且非反向重復部分的序列也是病毒來源的保守序列，在轉基因植物中也能產生dsRNA，因此能有效地提高RNAi載體的抗病毒效率。本研究構建的RNAi表達載體同時靶標PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個保守區域的靶序列，能有效提高沉默效率，為利用RNAi技術培育廣譜、高效、穩定且安全性高、同時抗PRSV 和PLDMV病毒病的轉基因番木瓜新種質奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

菌株與質粒：大腸桿菌 Escherichia coli DH5α 菌株、克隆載體pRTL-SalI和植物表達載體pPTN200 均由本實驗室保存。

酶與試劑：各種限制性內切酶購自Ferments公司，PCR Mix購自TaKaRa公司，克隆載體pMD18、pMD19及質粒提取試劑盒購自QIAGEN公司。

1.2試驗方法

1.2.1合成序列設計 搜索 GenBank中PRSV和PLDMV兩種病毒的基因組序列，用DNAMAN軟件分別進行序列比對后選取PRSV 和PLDMV的Nib和Hc-Pro基因的多個保守區域，總長為621 bp（圖 1）。靶序列由TaKaRa 公司合成。

1.2.2靶序列克隆 根據上述人工合成的靶序列設計兩對引物（表1），分別擴增長短不同但大部分序列重疊的兩個靶序列，在合成靶序列中的位置如圖1所示，引物由TaKaRa 公司合成。

圖1 人工合成靶序列

表1 引物序列及擴增片段

以上述合成靶序列為模板，用LF/LR和SF/SR為引物，進行PCR擴增，獲得大小分別為598 bp和530 bp的靶序列L和S。PCR擴增體系：5 ng/μL合成靶序列1 μL，10 X Pfu Buffer，dNTP Mix 4 μL（2.5 μmol/L），上游和下游引物各1 μL，Pfu 0.5 μL，補ddH2O至總體積50 μL。擴增條件：98℃，30 s；98℃，8 s，65℃，10 s，72℃，30 s，35個循環；72℃，10 min。PCR產物L和R分別與克隆載體pMD19和 pMD18連接，具體操作方法參照QIAGEN公司連接試劑盒說明書。連接產物分別轉化大腸桿菌Ecoil DH5α，提取質粒，獲得pMD19-L和pMD18-S重組子。用LF/SR為引物進行菌PCR檢測，反應體系30 μL，PCR擴增條件：94℃，3 min；94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min，35個循環；72℃，10 min。PCR檢測陽性的pMD19-L重組子進一步用EcoRⅠ/KpnⅠ雙酶切和測序鑒定。PCR檢測陽性的pMD18-S重組子用EcoR Ⅰ/NcoⅠ進行雙酶切鑒定，由于pMD18-T載體5’端有EcoRⅠ位點而靶序列S正向引物已添加NcoⅠ位點，如果靶序列S是反向插入，則pMD18-S重組子中EcoRⅠ和NcoⅠ分別位于靶序列兩側，EcoRⅠ/NcoⅠ雙酶切能切下約500 bp的目的片段；而如果靶序列S是正向插入，則pMD18-S重組子中EcoRⅠ和NcoⅠ位于靶序列同一側，EcoRⅠ/NcoⅠ雙酶切只能將載體線性化。選取靶序列S為反向插入的pMD18-S重組子進行測序鑒定。

1.2.3RNAi克隆載體pMD18-LS構建 選擇靶序列S為反向插入的克隆pMD18-S，并利用pMD18載體上5’端自帶的EcoRⅠ和KpnⅠ將pMD18-S質粒DNA線性化。將EcoRⅠ/KpnⅠ酶切pMD19-L質粒DNA，回收靶序列L并與線性化的pMD18-S連接，使靶序列L定向插入pMD18-S構建成靶序列L和S反向連接的RNAi克隆載體pMD18-LS，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。重組質粒用EcoRⅠ/NcoⅠ進行雙酶切鑒定。

1.2.4RNAi中間表達載體構建 pMD18-LS質粒DNA經EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切，切出約1 100 bp靶序列LS，回收目的片段并與EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切線性化后的中間表達載體pRTL-SalⅠ連接，轉化大腸桿菌DH5α，構建RNAi中間表達載體pRTL-LS。重組質粒用PstⅠ單酶切鑒定。

1.2.5 RNAi表達載體構建 PstⅠ單酶切pRTLLS質粒DNA，切出約1 600 bp的片段，回收目的片段，將其插入同樣經PstⅠ單酶切的表達載體pPTN200，構建RNAi表達載體pPTN-LS。轉化大腸桿菌DH5α，用LF和SR為引物進行PCR檢測后再用PstⅠ單酶切鑒定。

2　結果與分析

2.1靶序列設計、合成

搜索GenBank中PRSV和PLDMV兩種病毒的基因組序列，用DNAMAN軟件分別進行序列比后選定兩種病毒的Nib和Hc-Pro基因多個共同保守區域，具體序列見表2。然后按PRSVNib1、PRSV-Nib2、PLDMV-Nib1、PLDMVNib2、PRSV-Hc-Pro、PLDMV-Hc-Pro順序排列，人工合成總長為621 bp的靶序列。

表2 合成靶序列的詳細信息

2.2靶序列克隆

圖2 靶序列L和S PCR 擴增

以人工合成靶序列為模板，分別以LF、LR 和SF、SR為引物，用高保真Taq酶進行PCR擴增，得到與靶序列L和S預期大小的目的條帶，分別為598、530 bp（圖2）；靶序列L和S分別與克隆載體pMD19和pMD18連接后，用LF和SR為引物進行菌落PCR檢測，均獲得預期大小約為500 bp的目的片段（圖3），說明靶序列L和S克隆成功。由于靶序列L的擴增引物中分別含有EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點，重組質粒pMD19-L進一步用EcoRⅠ/KpnⅠ酶切，切下一條大約600 bp預期大小的目的條帶（圖4），證明pMD19-L克隆成功，測序后通過DNAMAN比對證明目的片段為合成靶序列的部分序列。由圖4可知，3、4號pMD18-S重組子切下一條大約500 bp預期大小的目的片段，說明靶序列S為反向插入；而5、6號pMD18-S重組子只是線性化，說明靶序列S為正向插入。取靶序列S為反向插入的pMD18-S重組子進行測序，通過DNAMAN比對證明目的片段為合成靶序列的部分序列，并且插入方向為反向。

圖3 靶序列克隆

圖4 酶切鑒定

2.3RNAi克隆載體pMD18-LS酶切鑒定

由于靶序列L和S是反向連接的，并且引物設計時靶序列L的上游引物已添加EcoRⅠ位點，而在靶序列S上游引物添加NcoⅠ位點，因此，用EcoRⅠ /NcoⅠ酶切pMD18-LS重組子，應切下包含靶序列S和L、大小約1 100 bp的片段。結果（圖5）顯示RNAi克隆載體pMD18-LS構建成功。

圖5 發夾結構克隆載體pMD18-LS酶切鑒定

2.4RNAi中間表達載體pRTL-LS的鑒定

用EcoRⅠ/SalⅠ酶切中間表達載體pRTLLS，切出一條預期大于2 000 bp包含插入片段、啟動子和終止子的目的條帶，而對照pRTL-SalⅠ切下小于2 000 bp僅包含啟動子和終止子的目的條帶（圖 6），說明中間表達載體構建成功。

圖6 發夾結構中間載體pRTL-LS酶切鑒定

2.5RNAi表達載體pPTN-LS的鑒定

以SF為上游引物、SR為下游引物，以pPTN-LS表達載體質粒DNA為模板進行PCR擴增，獲得大小約500 bp的目的條帶（圖7）。進一步用PstⅠ進行酶切鑒定，切出一條大于5 000 bp的目的條帶（圖8），證明已成功構建pPTN-LS RNAi載體。

3　討論

圖7 RNAi載體pPTN-LS構建

圖8 pPTN-LS酶切鑒定

RNAi是指雙鏈RNA（dsRNA）或帶部分雙鏈的發夾結構（hpRNA）被切割加工成小的干擾RNA（siRNA），siRNA利用堿基互補的原則指導RNA沉默誘導復合物（RISC）的Argnaute蛋白降解同源RNA或抑制它們的翻譯或者修飾同源DNA，從而抑制其表達。在植物中，除了能調控其生長發育，RNA沉默在植物抵抗病毒的入侵同樣起著非常重要的作用［1，12］。由于不需要產生新的蛋白，運用RNAi進行抗病毒育種具有高效、特異和安全等特點，因此已成為最有效的抗病毒策略之一。

為獲得抵抗多種病毒病的植株，可將多個目的基因轉入植物中并得以表達。構建RNAi表達載體有兩種方法和途徑：一是將1個目的基因插入到1個表達載體，構建多個不同的表達載體；二是將多個目的基金融合構建1個多基因表達載體，包括將多種病毒的保守片段連接成長片段，以相反方向插入到內含子序列（形成發夾結構的環）兩端，形成具有長的反向重復序列的RNAi載體［13］或每種病毒的保守序列各自形成小的發夾結構后再連接一起［11］。本研究采用第二種方法并加以改進，與已報道的抗多種病毒RNAi載體的構建方法不同之處在于：（1）本研究通過對GenBank 中的危害番木瓜的兩種主要病毒番木瓜環斑病毒（PRSV）和番木瓜畸形花葉病毒（PLDMV）的多條基因組全長序列進行比對，直接人工合成包含PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個保守區域的靶序列；（2）以人工合成靶序列為模板，設計擴增長短不同但大部分重疊的兩對引物，最后通過引物設計時添加的特定酶切位點使長短不同的兩個靶序列反向連接，形成以長靶序列的5’一部分序列作為發夾結構的環，不需要另外插入內含子序列的反向重復發夾結構的RNAi表達載體。本研究采用的RNAi表達載體具有以下優點：（1）避免載體構建過程中由于長的反向重復序列可能發生重組，導致載體內含子序列的截斷或缺失，增加載體構建的難度和降低載體的穩定性；（2）避免反復酶切、連接，簡化操作過程；（3）較短的序列就能包含更多的保守序列，提高抗病毒效率；（4）具有反向重復發夾結構RNAi載體產生dsRNA的效率更高，并且非反向重復部分的序列也是病毒來源的保守序列，在轉基因植物中也能產生dsRNA，因此能有效的提高RNAi載體的抗病毒效率。

Nib對病毒復制起關鍵作用，并在各病毒株系中比較保守。Hc-Pro不僅具有蛋白酶活性，作為蚜傳輔助因子參與病毒蚜傳過程，調節病毒中宿主體內的轉移，并且是馬鈴薯Y病毒屬病毒的沉默抑制子，在病毒復制、宿主癥狀表達及增強異源病毒復制等方面發揮作用。本研究構建的RNAi表達載體同時靶標PRSV和PLDMV兩種病毒的NIb和Hc-Pro基因多個保守區域的靶序列，能有效提高沉默效率，為利用RNAi技術培育廣譜、高效、穩定且安全性高，同時抗PRSV和PLDMV病毒病的轉基因番木瓜新種質的奠定基礎。

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（責任編輯 鄒移光）

Rapid construction of multiple target RNAi expression vector from synthesized fragment

ZHANG Xiu-chun，WU Kun-xin，ZHAO Ping-juan，LIU Zhi-xin
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou 571101，China）

Papaya production is seriously limited by Papaya ringspot virus （PRSV） worldwide and Papaya leaf-distortion mosaic virus （PLDMV） in Eastern Asia. To develop transgenic papaya lines with robust resistance to both of PRSV and PLDMV viruses， we took advantage of a sythesized fragment which included several conserved segments of Nib and Hc-Pro gene of PRSV and PLDMV to constructe pPTN-LS RNAi expression vector. The pPTNLS RNAi expression vector was constructed by two fragments with different length and inverted repeat （IR） deriving from the sythesized fragment. The IR part served as stem while the extending part of the longer fragment served as loop of the hairpin structure of pPTN-LS respectively. Since it didn’t need to insert additional intron，the method of RNAi expression vector construction mentioned above was fast and the result was stable as well. The transgenic Papaya engineering with pPTN-LS should be robust resistant to PRSV and PLDMV at the same time，because the sythesized fragment was derived from the highly conserved regions of Nib and Hc-Pro gene of PRSV and PLDMV. The study may pave the way to develop transgenic papaya lines with robust resistance to both of PRSV and PLDMV viruses.

sythesized fragment；papaya ringspot virus；papaya leaf-distortion mosaic virus；RNAi expression vector

S667.9

A

1004-874X（2016）07-0081-06

2016-03-23

國家自然科學基金（31201264）

張秀春（1972-），女，博士，副研究員，E-mail：zhangxiuchun@itbb.org.cn

劉志昕（1963-），男，博士，研究員，E-mail：liuzhixin@itbb.org.cn