基于PCR技術(shù)的木材腐朽菌鑒定方法的研究

馮　璐，戚大偉

(東北林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，哈爾濱 150040)

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基于PCR技術(shù)的木材腐朽菌鑒定方法的研究

馮璐，戚大偉*

(東北林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，哈爾濱 150040)

木材腐朽菌侵染木材而造成的木材腐朽現(xiàn)象會(huì)對(duì)木材的質(zhì)量有著很大的影響，為了鑒定木材腐朽的病原菌，基于PCR技術(shù)設(shè)計(jì)了一種快速鑒定木材腐朽病原菌的方法。首先從腐朽木材上分離純化得到兩種病原菌，之后對(duì)兩種病原菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，通過(guò)觀察其培養(yǎng)特性對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。隨后設(shè)計(jì)了7組引物，對(duì)兩種病原菌進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并通過(guò)BLAST對(duì)比鑒定出這兩種木材腐朽病原菌。研究結(jié)果表明，木材腐朽菌A為彩絨革蓋菌，木材腐朽菌B屬于多孔菌屬真菌。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，而基于PCR技術(shù)的的鑒定方法更為簡(jiǎn)便快捷且精確，證明了該方法的可行性。

木材腐朽病原菌；PCR；引物設(shè)計(jì)；分子水平鑒定

0　引　言

木材在人類生產(chǎn)生活的各個(gè)方面有著非常重要的作用，但是隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展木材資源已經(jīng)供不應(yīng)求，保證木材的質(zhì)量顯得尤為重要。在影響木材質(zhì)量的眾多因素中，由木材腐朽菌侵染木材而引起的木材腐朽現(xiàn)象十分常見(jiàn)。木材腐朽發(fā)生頻率高并且影響范圍廣，對(duì)木材質(zhì)量造成不可逆的破壞，每年由木材腐朽引起的木材資源流失數(shù)目龐大，對(duì)人們的生產(chǎn)和生活也帶來(lái)了嚴(yán)重的影響。為了合理使用木材資源，減小由木材腐朽菌造成的大面積木材腐朽，人們對(duì)木材腐朽和木材腐朽菌作了深入的研究[1]。目前鑒定木材腐朽菌的方法主要有兩種，一種是傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，即通過(guò)觀察菌落宏觀培養(yǎng)特性和微觀培養(yǎng)特性的特征來(lái)對(duì)菌種進(jìn)行鑒定和分類；另一種是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子水平的鑒定方法[2]，該方法依賴于PCR技術(shù)，通過(guò)擴(kuò)增未知菌種的DNA序列，測(cè)序后與基因庫(kù)內(nèi)已知菌種進(jìn)行比對(duì)來(lái)鑒定木材腐朽菌。PCR在物種鑒定上的應(yīng)用集中在醫(yī)學(xué)病原菌的鑒定、農(nóng)副產(chǎn)品的鑒定上，而將PCR技術(shù)運(yùn)用到木材腐朽的病原菌上的研究才剛剛開(kāi)始[3-9]。

1　木材腐朽菌形態(tài)學(xué)鑒定

1.1木材腐朽菌的采集和篩選

菌種來(lái)源：菌種采集于東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)，從人工水曲柳林病株上采集新鮮子實(shí)體，并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

用75%的酒精對(duì)新鮮的子實(shí)體進(jìn)行消毒后在無(wú)菌環(huán)境下將其切割成0.2 cm3的組織塊，用70%酒精對(duì)組織塊表面進(jìn)行消毒，之后放入0.1%升汞消毒液中浸泡2 min，立即用無(wú)菌水沖洗3次，然后用鑷子接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，將斜面培養(yǎng)基放置于25℃生物培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)并每天觀察菌種的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)菌絲布滿斜面時(shí)即完成菌種的分離[10-11]。經(jīng)過(guò)分離獲得了A、B兩種木材腐朽菌。

1.2木材腐朽菌的生物學(xué)特性

1.2.1溫度

選取5種不同溫度對(duì)兩種真菌進(jìn)行培養(yǎng)，分別為15、20、25、30、35℃[12]，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，控制其他培養(yǎng)基成分相同(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌20 min)，之后將已接種的各組培養(yǎng)皿置于不同溫度的生物培養(yǎng)箱中自然光條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄A、B兩菌種的生長(zhǎng)情況，記錄第7天時(shí)每組菌落的平均直徑。

1.2.2pH值

選取5種不同酸堿度的PDA培養(yǎng)基對(duì)兩種真菌進(jìn)行培養(yǎng)，分別為pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 7.5、pH自然(經(jīng)測(cè)pH=6.8)[13]，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，控制其他培養(yǎng)基成分相同(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min)，之后將已接種的各組培養(yǎng)皿放置于25℃生物培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄A、B兩木材腐朽菌菌種的生長(zhǎng)情況，記錄第7天時(shí)每組菌落的平均直徑。

1.2.3光照強(qiáng)度

分別將生物培養(yǎng)箱的光照強(qiáng)度設(shè)置為0、1 000、2 000、3 000 lux[12]，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，控制其他培養(yǎng)基成分相同(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL，溫度25℃，pH自然，121℃滅菌20 min)，之后將接種的培養(yǎng)基置于不同溫度的生物培養(yǎng)箱中自然光條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄A、B兩菌種的生長(zhǎng)情況，記錄第7天時(shí)每組菌落的平均直徑。

1.3木材腐朽菌的形態(tài)學(xué)特性

1.3.1菌落特征

當(dāng)菌絲生長(zhǎng)至接近培養(yǎng)皿邊緣10 mm時(shí)打開(kāi)培養(yǎng)皿上蓋[7]，將培養(yǎng)皿至于水平臺(tái)上，用普通數(shù)碼相機(jī)拍攝菌落此時(shí)的生長(zhǎng)狀況。

1.3.2菌絲特征

制作菌絲體玻片，置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2　基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)鑒定

2.1PCR引物的設(shè)計(jì)

引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR擴(kuò)增的成功與否。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。用特異性引物擴(kuò)增ITS區(qū)段這種方法允許所擴(kuò)增ITS區(qū)段的測(cè)序結(jié)果存在一定的誤差，由于木材腐朽菌ITS區(qū)段的長(zhǎng)度一般都在400bp以上，所以少量誤差并不會(huì)影響最終鑒定結(jié)果[14-17]。在對(duì)ITS區(qū)段的DNA序列進(jìn)行分析時(shí)，即使DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有被鑒定菌株所屬物種的DNA序列，通過(guò)BLAST軟件搜索出的物種也應(yīng)是數(shù)據(jù)庫(kù)中與被鑒定物種最近緣的物種，結(jié)合經(jīng)典鑒定方法也可以對(duì)菌種做出正確的鑒定。

本文共設(shè)計(jì)了7對(duì)引物對(duì)供試材料的rDNA ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這7對(duì)引物分別是：Fung / ITS4，ITS1 / ITS4，NS1 / NS4，OPAA11 / OPAA18，OPD18 / OPD15，OPAA17 / OPO15，OPAA11 / OPD18。

各引物序列如下：

2.2反應(yīng)條件的設(shè)計(jì)與優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系(20 μl)如下：

注：不足20 μl的體積用dd H2O補(bǔ)足。每次反應(yīng)均以無(wú)菌去離子水替代模板DNA作為空白對(duì)照[18]。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間大概兩小時(shí)，熱循環(huán)參數(shù)設(shè)定如下：

3　結(jié)果與分析

3.1形態(tài)學(xué)鑒定

3.1.1生物學(xué)特征

木材腐朽菌A的適宜生長(zhǎng)溫度為20～25℃，最適生長(zhǎng)溫度為25℃。15～25℃時(shí)，菌種的生長(zhǎng)速率隨著溫度的升高而增高，25℃是達(dá)到最高，之后生長(zhǎng)速率急速降低。木材腐朽菌B生長(zhǎng)速率與木材腐朽菌A基本相同。不同溫度下兩種木材腐朽菌的生長(zhǎng)速率如圖1和圖2所示。

圖1　不同溫度下菌落A的生長(zhǎng)速率Fig.1 The growth rate of colony A under different temperature

圖2　不同溫度下菌落B的生長(zhǎng)速率圖Fig.2 The growth rate of colony B under different temperature

兩種木材腐朽菌的最適生長(zhǎng)pH值均為7左右，但由于PDA培養(yǎng)基自然狀態(tài)下(不用酸堿調(diào)節(jié)pH的情況下)pH約為6.8，此時(shí)兩菌種的生長(zhǎng)速率和pH=7時(shí)的生長(zhǎng)速率非常接近，為了方便操作、節(jié)省資源，可以選擇pH自然狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)。不同溫度下兩種木材腐朽菌的生長(zhǎng)速率如圖3和圖4所示。

圖3　不同pH下菌落A的生長(zhǎng)速率Fig.3 The growth rate of colony A under different pH

圖4　不同pH下菌落B的生長(zhǎng)速率Fig.4 The growth rate of colony B under different pH

兩種木材腐朽菌對(duì)光照不敏感，在不同的光照條件下生長(zhǎng)速率基本相同，說(shuō)明光照強(qiáng)度對(duì)兩種木材腐朽菌的生長(zhǎng)基本沒(méi)有影響。

3.1.2形態(tài)學(xué)特征

對(duì)兩種木材腐朽菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，通過(guò)數(shù)碼照相機(jī)照相后結(jié)果如圖5和圖6所示。

圖5　木材腐朽菌A的菌落生長(zhǎng)狀況Fig.5 The colony’s growth condition of wood-decaying fungi A

菌種A：生長(zhǎng)速率快，1～2周覆蓋平板；菌落邊緣為鋸齒狀；菌絲體緊貼于瓊脂培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)；菌絲短而纖細(xì)，疏松地排列在培養(yǎng)基表面，形成一個(gè)絨毛狀菌落；菌落保持白色或奶油色；表面較平滑；在6周前反面部分變褐；生長(zhǎng)新區(qū)的邊緣菌絲為升起的羊毛狀；培養(yǎng)皿對(duì)光觀察，不能分清單個(gè)菌絲的尖端。

圖6　木材腐朽菌B的菌落生長(zhǎng)狀況Fig.6 The colony’s growth condition of wood-decaying fungi B

菌種B：生長(zhǎng)速率快，2周覆蓋平板；菌落邊緣為鋸齒狀；菌絲體在培養(yǎng)基內(nèi)部生長(zhǎng)，在表面之下；菌絲緊密扭結(jié)，形成一個(gè)白色外皮殼，較硬且不易剝落；菌落保持白色；在6周前反面部分變褐；生長(zhǎng)新區(qū)的邊緣菌絲平伏在培養(yǎng)基表面；培養(yǎng)皿對(duì)光觀察，能夠分清單個(gè)菌絲的尖端。

挑取兩種木材腐朽菌做成臨時(shí)裝片，分別置于光學(xué)顯微鏡下觀察，得到結(jié)果如圖7和圖8所示。

圖7　光學(xué)顯微鏡下木材腐朽菌A的菌絲照片F(xiàn)ig.7 The mycelium photos of wood-decaying fungi A under optical microscope

菌種A：生長(zhǎng)新區(qū)的菌絲無(wú)色，節(jié)狀分隔；氣生菌絲像生長(zhǎng)新區(qū)的菌絲，具有垂直分枝；纖維菌絲較多，壁厚，時(shí)常分枝，彎曲和交織在一起；分生節(jié)有孢子。

菌種B：生長(zhǎng)新區(qū)的菌絲無(wú)色，多分枝，有內(nèi)含物，節(jié)狀分隔很多，柔軟；氣生菌絲像生長(zhǎng)新區(qū)的菌絲；纖維菌絲多，顏色深，分枝較明顯，中空或有內(nèi)含物；擔(dān)孢子透明，均勻，圓柱形。

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)觀察菌種A、B的宏觀和微觀特征，包括菌種的最適生長(zhǎng)環(huán)境，菌落的顏色、質(zhì)地、生長(zhǎng)速率、邊緣特征，顯微鏡下各個(gè)階層菌絲的形狀、生長(zhǎng)狀況等，可以大致判斷出兩種木材腐朽菌所屬的科屬情況。真菌A屬于擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、栓菌屬；木材腐朽菌B屬于擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、多孔菌屬。

3.2分子生物學(xué)鑒定

對(duì)兩種木材腐朽菌7對(duì)引物擴(kuò)增后得到的DNA序列分別登陸GeneBank，在DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源DNA序列的搜索工作，并進(jìn)行BLAST對(duì)比，根據(jù)BLAST搜索和比較的結(jié)果，判斷菌絲體菌種的物種或與其近緣的物種[19-20]。

登錄GenBank，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列相似性檢索，引物1擴(kuò)增序列對(duì)比得到與菌種A相似率為96%的為Trametes versicolor(L.)Lloyd.彩絨革蓋菌，引物2擴(kuò)增序列檢測(cè)到與被試樣品序列相似性為85%以上的菌種3種，引物3、5、6、7擴(kuò)增產(chǎn)物并未在genebank上找到與其相似性達(dá)到50%以上的已知序列，引物4擴(kuò)增序列檢測(cè)到與被試樣品相似率為83%以上的4種菌。而之前經(jīng)典形態(tài)學(xué)鑒定方法對(duì)該菌種的子實(shí)體照片、菌落照片、菌絲照片的鑒定結(jié)果是木材腐朽菌A為采絨革蓋菌。

在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列相似性檢索，未檢測(cè)到木材腐朽菌B這個(gè)種，但與菌種B相似率在85%以上的同源物種序列共有9個(gè)，將這9個(gè)序列同測(cè)得的菌種B序列一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。從圖中可以看出，10個(gè)序列形成3個(gè)大的聚類組，木材腐朽菌B與多孔菌屬其他種同屬于一個(gè)聚類組，每個(gè)分支間的自舉支持率都很高(>87%)，序列差異小，親緣關(guān)系近。菌種B與另兩個(gè)聚類組的自舉支持率都很低(<50%)，序列差異大，說(shuō)明其親緣關(guān)系遠(yuǎn)。由此可以確定木材腐朽菌B屬于多孔菌屬真菌，如圖9所示。

圖9　用ITS序列構(gòu)建的木材腐朽菌B系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.9 Wood-decaying fungi B phylogenetic tree constructed of ITS sequence

4　結(jié)　論

本文用PCR方法快速鑒定了兩種木材腐朽菌，并結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，通過(guò)對(duì)比分析兩種鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種鑒定方法得到的結(jié)果一致。但對(duì)木材腐朽菌A進(jìn)行鑒定時(shí)，分子水平的鑒定精確到了種的水平，而傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法只能判定該菌種是臥孔菌屬，并不能判定它是哪種菌種。因此在基于PCR技術(shù)的木材腐朽菌快速鑒定方法更加精確。

然而，基于PCR技術(shù)的木材腐朽菌快速鑒定方法也存在一定的局限性，由于ITS序列的高度保守性，種間關(guān)系相近的種的ITS序列之間的差異非常微小，所以這種分子鑒定方法不適合于屬內(nèi)種及種群間的鑒定[14-15]，只有把傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法和基于PCR技術(shù)的鑒定方法想結(jié)合，才能得到更加可靠地鑒定結(jié)果。

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Study on Identification of Wood-decayingFungi Based on PCR Technique

Feng Lu，Qi Dawei*

(College of Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040)

Wood decay caused by wood-decaying fungi will affect the wood quality.In order to investigate the pathogens resulted in wood decay，a new method was designed to rapidly identify wood-decaying fungi based on PCR(Polymerase chain reaction)technique.Two pathogens separated and depurated from decayed wood were cultivated in the laboratory，and then wood-decaying fungi was identified by morphological identification method.Seven groups of primer were designed to refine and amplify the PCR conditions.Two wood-decaying pathogens were compared and identified with BLAST.Results showed that wood-decaying fungi A wasTrametesversicolor(L.)Lloydwood-decaying fungi and fungi B belonged toPolyporaceaePolyporus.The results obtained by molecular identification were consistent with that by morphological identification.It is proven that the identification method based on molecular is feasible due to its rapid and accurate characteristics.

wood-decaying fungi；PCR；primer design；molecular identifications

2016-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(31570712)

馮璐，碩士研究生。研究方向：生物物理。

戚大偉，博士，教授。研究方向:生物物理。

馮璐，戚大偉.基于PCR技術(shù)的木材腐朽菌鑒定方法的研究[J].森林工程，2016，32(5)：35-39.

S 782.3

A

1001-005X(2016)05-0035-05

E-mal：qidw9806@126.com