耐超高溫α-淀粉酶的研制

李謝晟（高二學生，項目研究者）張四槐（項目指導教師）

耐超高溫α-淀粉酶的研制

對射線處理后的地衣芽孢桿菌進行篩選，獲得一株能耐100℃高溫的菌株。對菌株產生的酶進行酶學性質研究表明，該酶在100℃下，酶活力是27500u/mL，耐高溫性和酶活力指標均超過國家標準。進行產酶發酵中試和超濾、鹽析提取實驗，結果是超濾法比鹽析法回收率高12.5%，酶的比活力高45.9%，成本低20%。酶制劑在酶活力、熱穩定性優于國家優等品標準，具有實用價值。

下文介紹該項目研制的過程。

一、材料與方法

（一）實驗材料和藥品

1.菌株

地衣芽孢桿菌（B.licheniformis），由湖南農大提供。

2.培養［1］

（1）瓊脂平板培養基。培養基配方∶胰蛋白胨1.5g，酵母膏0.7g，NaCl1.0g，瓊脂2.0g，可溶性淀粉1.0g，pH值7.0，其余為水，合計總重100g。上述100g配料混勻后分放于培養皿，0.1MPa滅菌30-35min，冷卻到室溫，制成瓊脂復壯培養基備用。

（2）基礎培養基。不加瓊脂，其他與瓊脂平板培養基相同。

（3）篩選培養基：在基礎培養基上加入2%瓊脂和0.01%曲利本藍。

（4）擴大培養基配方：胰蛋白胨1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.7%，NaCl0.9-1.1%，可溶性淀粉1%，pH值6.5-7.0，其余為水，合計總重5kg，0.1MPa滅菌30-35min，冷卻到40℃，制成擴大培養基，備用。

（5）液態發酵培養基配方：（NH4）2SO40.22-0.27%，KH2PO40.30-0.37%，CaCl20.015-0.02%，可溶性淀粉0.25-0.30%，胰蛋白胨0.35-0.45%，玉米粉2.9-3.5%，pH值6.5-7.0，其余為水，合計總重50kg，0.1MPa滅菌30-35min，冷卻到40℃，制成液態發酵培養基，備用。

3.主要試劑、材料

硅藻土，原碘液，稀碘液［2］，磺化聚砜∶超微濾膜（型號YM-200），20g/L可溶性淀粉溶液，磷酸緩沖液，NaOH溶液（0.5mol/L），鹽酸溶液（0.1mol/L）。曲利本藍。

4.主要儀器

板框壓濾機，Unic7200型可見分光光度計，PL303型電子天平，HH-6型恒溫水浴鍋，電子萬用爐，PHS-3C型pH計，離心機，XK96-B型快速混勻器，高壓消毒器，超凈工作臺，培養箱，恒溫箱。

（二）實驗方法

1.菌株篩選、分離

取活化培養的地衣芽孢桿菌，加入裝有45mL無菌水的小三角瓶中，取0.1mL梯度稀釋（10-5、10-4、10-3）涂布到篩選平板上，37℃±1℃培養60h，測量D/d（水解圈直徑/菌落直徑）值，挑選出比值較大的保存。

之后，將篩選得到的菌純化后進行液體培養。培養60h，取培養液離心后收集上清液，經超濾濃縮得到酶液，在100℃下進行α-淀粉酶活性測定，選取酶活高的菌株進行傳代培養。

2.產酶發酵

（1）基礎培養：取平板培養后的地衣芽孢桿菌，接種于100mL基礎培養基中，180r/min、36℃±1℃恒溫培養40h。

（2）擴大培養：取步聚（1）制成的瓊脂培養基菌種，按擴大培養基重0.8%的接種量，接種到冷卻到40℃的擴大培養基，36℃±1℃恒溫培養60-70小時。恒溫培養時，不斷攪拌通風，攪拌速度為300-320轉/分鐘，通風量為1.3-1.5立方氣體/升培養基/分鐘，制成擴大培養液。

（3）液態發酵培養：取（2）步聚的擴大培養液，按液態發酵培養基重2.5-3.5%的接種量，接種到冷卻到40℃的液態發酵培養基中，36℃±1℃恒溫培養60-70小時。恒溫培養時，不斷攪拌通風，攪拌速度為300-350轉/分鐘，通風量為1.3-1.5立方氣體/升培養基/分鐘，制成液態發酵液。

2.淀粉酶活力的測定

國標法——分光光度計法［2］

方法步驟：吸取可溶性淀粉溶液20.00mL于各具塞試管中→加入緩沖液5.00mL搖勻→控溫5min→加入稀釋好的待測酶液1.00mL→計時、搖勻、準確反應5min→吸取反應液1.00mL→加稀碘液5.00mL，搖勻→稀碘液作空白，于波長660nm處迅速測定吸光度。

根據其吸光度查表Al，求得測試酶液的濃度（c），再計算酶活力。

X=c×n×16.67。（式中：X—樣品的酶活力（u/mL），c—測試酶的濃度，n—樣品的稀釋倍數，16.67—換算常數）

3.α-淀粉酶最適溫度的測定：在磷酸緩沖液（pH值6.0）的反應體系中［2］，將反應溫度分別控制在50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃下，分別用1%淀粉溶液作為底物進行酶催化反應，測量酶活力［2］。

4.α-淀粉酶熱穩定性的測定［3］：取適量酶液（添加或不添加Ca2+）分別在不同溫度（70℃、80℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃和115℃）下保溫1h后，迅速置于4℃冰箱內降溫，然后統一在標準條件下測定殘余酶活，以未處理的酶液的酶活設為100%。

5.α-淀粉酶最適pH值的測定［2］：配制pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的醋酸鹽緩沖液和pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5的Tris-HCl緩沖液，通過改變反應體系的pH值，測定不同pH值下酶活力大小。

6.α-淀粉酶的提取、純化。

（1）方法1：板框壓濾→酶的超濾濃縮及精制。

粗濾：往上述發酵好的液態發酵液中添加液態發酵液重4-6%的硅藻土，混合均勻后裝入板框壓濾機，以0.6兆帕壓力壓濾，實現固液分離，收集酶的濾液。工作原理是依靠壓緊裝置將濾板壓緊，再將懸浮液用泵壓入濾室，通過濾布來達到將固體顆粒和液體分離的目的。

酶的超濾濃縮及精制［4］：酶的濾液中含有許多無機鹽、糖和氨基酸之類的低分子物質，它們對酶制劑的顏色、氣味、酶含量等都有很大的影響。α-淀粉酶的分子質量在10000Da-100000Da之間，這個范圍恰好在超濾技術應用的范圍之內。采用超濾技術過濾粗酶液，低分子物質和鹽類可以與水一起經膜孔除去，而酶被濃縮和精制。以微濾膜（磺化聚砜）將步聚4粗濾液過濾濃縮5倍，濃縮液以塑料桶裝，在室溫（5-25℃）溫度下保存即可。

（2）方法2：酶的鹽析法濃縮及精制［3］。技術路線：離心→硫酸銨鹽析→透析、除鹽。具體操作：將發酵液進行離心（40℃，8000r/min，30min），收集上清液取→取上清液，經40%硫酸銨鹽析，4℃靜置4h，離心（40℃，9000r/min，30min）取上清夜→以80%硫酸銨鹽析，4℃靜置過夜，離心（40℃，10000r/min，30min）收集沉淀→用少量蒸餾水溶解沉淀，通過透析方法除鹽。

二、結果與分析

1.菌株篩選、分離結果

用選擇平板進行初篩，以水解圈大小為指標，初篩到5個菌落（分別標號為：ABCDE）對這五個菌落進行3次劃線分離、純化。

把A、B、C、D、E菌分別進行液體培養，收集酶液，在100℃下測α-淀粉酶活性，C、D菌株產生的α-淀粉酶在100℃下有活性，其中D菌株較高，為27500u/mL。

2.酶的作用溫度

實驗測定溫度對α-淀粉酶活性影響的結果如表1。

溫度℃70℃80℃85℃90℃95℃100℃105℃110℃115℃酶活力（u/mL）7000 11000 14800 19500 23000 27500 28300 22500 11000

數據表明，菌株產生的α-淀粉酶在pH值為6.0時，酶作用的最適溫度為105℃左右。105℃時，酶活力為28300u/mL。在110℃仍有81%的酶活力，以國家標準2000u/mL考慮，適宜溫度范圍92-110℃。從70℃到105℃，隨溫度升高，活性增長；超過105℃，酶活性隨溫度升高而降低。

3.酶的熱穩定性

酶的熱穩定性實驗結果如表2。

溫度70℃80℃90℃95℃100℃105℃110℃115℃對照組相對酶活力100% 100% 100% 100% 100% 95% 80% 40% 100%

數據表明在最適溫度105℃下處理1小時后，酶耐熱性存活率95%，100℃以下酶耐熱性存活率100%。國家標準［2］為：酶耐熱性存活率95℃，60min大于或等于95%。說明此α-淀粉酶熱穩定性好，高于國家標準。

4.反應pH值對酶活性的影響

表3反應pH值對酶活性的影響

從表3可以看出，該酶的最適pH值為5.5左右，在pH值5.0-6.5之間，酶活性在80%以上，是一種適合偏酸型的α-淀粉酶。pH值在4.0-5.5時，隨pH值升高，酶活性增強。超過5.5，隨PH值升高，酶活性降低。

5.α-淀粉酶的提取、純化

發酵液經兩種提取、純化方法分別得到發酵上清液、硫酸銨沉淀純化液，板框壓濾液、超濾純化液，對上述四種提取物進行酶活、回收率、純化倍數進行測定和計算

兩種分離純化結果如表4。

表4α-淀粉酶分離純化

進行統計分析，方法1與方法2相比，P＜0.01，差異顯著。數據表明，超濾法比鹽析法回收率高12.5%，酶的比活力高45.9%，說明超濾法比鹽析法在收到的酶數量、酶活性高，且差異顯著。超濾法提取成本低20%。

三、討論

淀粉的水解過程通常包括兩步：液化和糖化。在液化階段，淀粉顆粒在噴射罐105-110℃經過5min的高溫噴射糊化成液狀。如果糊化溫度低于105℃，則淀粉糊化不完全，將影響后續的過濾過程。但目前使用的α-淀粉酶最適作用條件為90℃，在溫度高于100℃時，會使酶失活。因此耐超高溫α-淀粉酶成為目前研究的熱點。本研究用地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）發酵產生的耐超高溫α-淀粉酶最適溫度為105℃，在110℃仍有81%的酶活力且酶活力超過國家標準，適合理想的液化條件。酶活力為28300u/mL，比國家標準20000提高了41%，催化效率高，降低生產成本，因此該酶有實用價值。

酶制劑的傳統生產工藝是發酵、絮凝沉淀、過濾、溶劑萃取、真空蒸發、干燥，其生產過程能耗高、酶失活率高、收率低。膜分離技術具有節約能源、降低損耗、可在常溫下連續操作、過程簡單、高效、無相變、分離系數較大等優點［5］。實驗數據表明，對于α-淀粉酶的提取，超濾法比鹽析法回收率高12.5%，酶的比活力高45.9%，成本低，說明超濾法適合α-淀粉酶的分離、提純。

此酶制劑符合國標，是一種應用廣的α-淀粉酶制劑，具有應用推廣價值。

（作者單位：婁底市第三中學婁底市第五中學）

［1］陳晨．耐高溫α-淀粉酶菌株的篩選、發酵條件優化及酶基因的克隆．2009中南大學碩士論文

［2］中華人民共和國輕工行業標準QB/T2306 -1997，耐高溫α-淀粉酶制劑．

［3］王淑軍、陸兆新、秦松等．超嗜熱古菌耐熱酸性α-淀粉酶的發酵條件和酶學性質研究［J］，海洋與湖沼，2009年1月．

［4］李香莉，呂莉萍，肖凱軍．膜分離技術在酶制劑工業中的應用［J］．食品研究與開發．

［5］石方方，焦國寶，丁長河，屈建航，屈凌波，劉仲敏．耐酸耐高溫α－淀粉酶的研究進展［J］．中國食品添加劑，2014年第4期．