冷藏條件下縊蟶、文蛤ATP關聯產物的變化及降解途徑的探究

王丹妮，邱偉強，陳舜勝，宋雪

(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

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冷藏條件下縊蟶、文蛤ATP關聯產物的變化及降解途徑的探究

王丹妮，邱偉強，陳舜勝*，宋雪

(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

為了研究冷藏條件下，縊蟶、文蛤三磷酸腺苷(ATP)及關聯產物的變化和降解途徑。采用高效液相色譜法對貯藏在4 ℃下的縊蟶和文蛤的9種ATP關聯物進行測定，分別為：三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate，ATP)，二磷酸腺苷 (adenosine diphosphate，ADP)，單磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)，肌苷酸(inosine monphosphate，IMP)，腺嘌呤核苷(adenosine，AdR)，次黃嘌呤核苷(inosine，HxR)，次黃嘌呤(hypoxanthine，Hx)，黃嘌呤(xanthine，Xt)和腺嘌呤(adenine，Ad)。研究發現，在4 ℃下，從縊蟶和文蛤中檢測到的產物都為ATP、ADP、AMP、IMP、AdR、HxR、Hx和Xt，未測到Ad。 ATP的初始值分別為1.033和0.824 μmol/g，試驗前4 d下降較快，之后緩慢下降；ADP呈下降趨勢；AMP、IMP、AdR和HxR含量先上升后下降；Xt呈上升趨勢；縊蟶中Hx呈上升趨勢，文蛤則先上升后下降。根據ATP關聯物的變化，推測2種貝類的代謝途徑為ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx→Xt和ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx→Xt，因文蛤中IMP含量極少，所以推測文蛤以第2條途徑為主。結合感官評價和TVB-N實驗發現，2種貝類的Kax值與感官評分和TVB-N均存在顯著相關性，Kax值可用于2種貝類的鮮度評價。

縊蟶；文蛤；ATP關聯產物；降解途徑；高效液相色譜

縊蟶(Sinonovaculaconstricta)，和文蛤(Meretrixmeretrix)分別屬于軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、簾蛤目(Veneroida)中的竹蟶科(Solenidae)和簾蛤科(Veneridae)[1-2]。作為我國重要的海產雙殼類，2014年我國蟶類、蛤類分別占貝類總產量的5.9%和29.5%[3]。目前貝類以鮮銷為主，加工業還很薄弱，由于收獲季集中，采捕期短，保鮮保活不當時，會造成變質，帶來巨大損失[4]。為了更有效地利用貝類，客觀評價其鮮度就顯得尤為重要。K值是將核苷酸的分解代謝產物作為鮮度指標的一種評價方法[5]，廣泛應用于魚類。由于人們對貝類核苷酸的分解途徑和產物仍存在爭議，普遍認為魚類和貝類核苷酸的分解途徑和產物不同，所以K值是否能夠客觀評價貝類鮮度，仍有待探究。近年來，對扇貝、牡蠣等貝類的ATP及關聯產物變化和降解途徑的研究較多，而縊蟶和文蛤研究較少，探究縊蟶和文蛤核苷酸的降解途徑有利于深入了解雙殼貝類核苷酸分解變化過程，為以后探究其他貝類的核苷酸降解途徑提供一種方法，并對貝類的加工利用帶來一定的指導。

本試驗采用高效液相色譜法，以縊蟶和文蛤為試驗對象，測定4 ℃貯藏期間，2種貝類ATP及關聯產物的變化，推測其降解途徑，并探究其適用于評價2種貝類鮮度K值的可行性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

縊蟶、文蛤，購買于上海古棕路水產品批發市場，均為新鮮健康活體(縊蟶長：5.5～6.7 cm，寬：1.7～2.2 cm；文蛤長：3.5～4.2 cm，寬：2.5～2.7 cm)，在鹽度為2.7%的鹽水中吐沙24 h，蒸餾水清洗，然后快速去半殼，殺死，2只作為一個樣本，取3個平行，裝入PE袋，置于4 ℃冰箱中待處理。

甲醇(色譜純)，德國Merck公司；KH2PO4、K2HPO4(色譜純)，上海安譜實驗科技股份有限公司；H3PO4、NaOH、高氯酸(優級純)，上海國藥集團；ATP、ADP、AMP、IMP、GMP、HxR、AdR、Hx、Xt、Ad標準品(純度≥99%)，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2儀器與設備

Waters e2695高效液相色譜系統，美國Waters有限公司；KUBOTA 520離心機，日本島津有限公司； 酸度計(pH計)，瑞士METTLER TOLEDO公司；H-2050R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；全自動凱氏定氮儀KJELTEC 8400，瑞典FOSS公司。

1.3實驗方法

1.3.1標準溶液配制

分別稱取10種標準品0.1 g于燒杯中，充分溶解，超純水定容至50 mL容量瓶中，并依次稀釋得到100，50、25、10和5 μg/mL的混合標準溶液梯度。

1.3.2樣品處理

從第0天(新鮮狀態)到第12天，每天取4 ℃貯藏條件下的縊蟶和文蛤約3 g，于冰浴條件下剪碎(每個樣品3個平行)，加入10% PCA 15 mL，研磨搗碎，然后5 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至燒杯中，置于4 ℃下，將所得沉淀物加入5% PCA 10 mL，研磨搗碎，5 000 r/min離心10 min，合并上清液，用2 mol/L KOH和H3PO4調節pH值至5.7，靜置于4 ℃下，然后超純水定容至50 mL容量瓶中。取樣品溶液2 mL過0.22 μm濾膜于進樣瓶中，待高效液相儀器(HPLC)分析。

1.3.3色譜條件

參照邱偉強等[6]的方法并稍作修改。色譜柱：島津ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相A：15 mmol/L KH2PO4和15 mmol/L K2HPO4(體積比1∶1)溶液，流動相B：純甲醇溶液；緩沖液pH值：5.7；流速：1 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長254 nm；測定時間35 min；梯度洗脫方法： 0～8 min，流動相A為100%； 8～10 min，流動相B線性增加至3%； 10～15 min，流動相B線性增加至6%； 15～23 min，流動相B線性增加至15%； 23～28 min，流動相B線性增加至30%； 28～30 min， 流動相A回到初始梯度狀態100%。

1.3.4感官評定實驗

試驗篩選8名感官評定人員，制定感官評價表(表1)。評定標準：最高為5分，最低為0分，設置外觀、氣味、肉質的權重分別為0.4，0.3和0.3。每個指標的平均分乘以權重，然后相加之和為感官評分[7-9]。評分越高，鮮度越好。5～4分為新鮮可食，4～3分為可接受，3～0為不可接受。

表1　雙殼貝類感官評價表

1.3.5揮發性鹽基氮的測定

按SC / T3032—2007[10]規定的方法測定。

1.3.6ATP關聯產物含量計算

用EXCLE2010，origin，SPSS等軟件進行統計。高效液相測得ATP及其代謝產物的面積，通過標準品線性關系計算得出相應的濃度值cm，用式(1)分別計算出待測樣品中9種ATP關聯產物的含量。

(1)

式中：x，待測樣品中9種ATP關聯產物的含量，μmol/g；cm，標準品線性關系計算得到的相應的濃度值，μg/mL；mx，待測樣品的總質量，g；Mx，9種ATP關聯物的摩爾質量，g/mol。

2　結果與分析

2.1高效液相色譜法測定ATP及關聯物標準品

試驗采用反相液相色譜法，為了排除2種貝類在試驗過程中可能產生GMP，造成干擾[6]，在9種ATP關聯產物標準品中加入GMP標準品。1.3.3色譜條件下，以標準品混合溶液作為檢測對象，對濃度梯度為5，10、25、50、100和200 μg/mL的混合標準溶液進行測定，每個梯度進樣3次，以保留時間作為定性依據，繪制10種標準品濃度與峰面積的標準曲線。

圖1　9種ATP關聯物及GMP標準品(100 μg/mL)的高效液相色譜圖Fig.1　Chromatogram of the standard solution of 9 ATP-related compounds and GMP(100 μg/mL)

2.2縊蟶、文蛤體內ATP及關聯產物的變化及分解途徑

2.2.1ATP及關聯產物的含量變化

縊蟶和文蛤在鮮活狀態下立即殺死，最初ATP的含量分別為1.033 μmol/g和0.824 μmol/g。于4 ℃下貯藏3 d，ATP快速下降，第3天縊蟶和文蛤ATP分別下降至0.205 μmol/g和0.172 μmol/g，比鮮活狀態時分別下降了80%和79%，下降幅度較大，如圖2，圖3所示。

圖2　在4 ℃下縊蟶貯藏期間ATP關聯物含量變化Fig.2　Changes in contents of ATP-related compounds in Sinonovacula constricta during storage at 4 ℃

圖3　在4 ℃下文蛤貯藏期間ATP關聯物含量變化Fig.3　Changes in contents of ATP-related compounds in Meretrix meretrix during storage at 4 ℃

這種現象與魚類ATP降解現象相似，劉壽春等[11]在冷藏羅非魚片中發現，ATP含量在前2 d下降了近80%。ATP快速下降的原因，可能因為貝類體內三磷酸腺苷酶活性較強，WATABE等[12]認為在死后的最初階段，因為肌細胞中Ca2+對肌漿網的吸附能力下降，導致其大量進入細胞液中，肌原纖維中的Ca2+的濃度增加，使得肌原纖維ATP酶被激活，從而引起ATP快速下降。初始ADP含量分別為1.074，0.694 μmol/g，呈下降趨勢。

2種貝類，初始AMP含量較少，縊蟶為0.563 μmol/g，文蛤為0.552 μmol/g，表現為先上升后下降的趨勢。縊蟶中有蓄積現象，在貯藏第5天達到最大值1.627 μmol/g，文蛤在第2天達到最大值1.250 μmol/g，隨后快速下降。湯水粉[13]在研究真鯛(Pagrosomusmajor)、鰤魚(Seriolaquinqueradiata)、紅甘魚(Kanpachi)、鱸魚(Lateolabraxjaponicus)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)的ATP關聯物變化時，發現ATP轉變成IMP的過程十分迅速，AMP含量沒有顯著增加且含量較低，這與2種貝類檢測到的結果不同，WANG等[14]在牡蠣(Ostreagigasthunberg)的閉殼肌，外套膜、鰓和其余部位中發現了與2種貝類相同的現象，這可能是貝類區別于魚類的特性。縊蟶在貯藏第4天檢測到IMP，含量為0.081 μmol/g，之后先上升后下降，最大值為0.133 μmol/g，于第12天消失。在第3天測到AdR，初始值0.067 μmol/g，呈先上升后下降趨勢，最大值為0.165 μmol/g，在第10天消失；IMP的含量與AdR相近。文蛤中只檢測到了極少量的IMP，AdR先上升后下降，最大值為0.624 μmol/g，遠高于縊蟶(圖2、圖3)。這說明2種貝類中同時存在IMP和AdR2種分解產物，因種類不同而導致含量不同，但變化趨勢相同。AMP和IMP不僅是ATP降解過程的中間產物，還具有重要的呈味作用，與魚類主要以IMP呈味不同，縊蟶和文蛤中IMP含量較少，AMP含量較高，因此核苷酸與谷氨酸和天門冬氨酸相乘產生的鮮味效果，為貝類主要鮮味來源[15]。

貯藏期間，縊蟶HxR含量較高，于第2天出現，第12天消失，先上升后下降。在第6天，當IMP和AdR緩慢下降時，HxR仍持續上升至第9天，說明HxR的合成速率大于HxR的分解速率，最大值為0.682 μmol/g。文蛤不同于縊蟶，僅在第6到第9天檢測到HxR，最大值為0.262 μmol/g，但Hx含量高，說明HxR快速分解為Hx。2種貝肉中HxR合成與分解速率不同，可能與貝肉中酶的活性相關。由于貝類初菌數較高，灘涂養殖的縊蟶和文蛤菌落總數均可達105CFU/g[16]，一些低溫菌在冷藏條件下十分活躍，造成了后期HxR快速下降。縊蟶體內在第6天檢測到Hx，Hx呈直線上升趨勢，文蛤第2天檢測到Hx，呈先上升后下降趨勢。Xt由黃嘌呤氧化酶作用于Hx產生，隨著貯藏時間的增加，2種貝類體內的Xt含量都不斷上升。

2.2.2兩種雙殼貝類核苷酸分解途徑探究

一般來說，核苷酸分解前期ATP→ADP→AMP的過程是相同的。而AMP因物種不同，而分解成不同的產物，已知的有3條途徑：AMP→IMP→HxR，AMP→AdR→HxR，AMP→AdR→Ad[16-17]。魚類中，通常核苷酸的降解途徑為AMP→IMP→HxR→Hx[18]；蝦中，邱偉強等[6]推測斑節對蝦(Penaeusmonodon)和羅氏沼蝦(Macrobrachuimrosenbergii)核苷酸的降解途徑為AMP→IMP→HxR(1%)和AMP→AdR→HxR(99%)；蟹類中，湯水粉等[19]從梭子蟹(Portunustrituberculatus)體內檢測到大量的IMP；對于貝類，SAITO[5]推測庫頁島厚蛤蜊(Spisulasachalinensis)和蝦夷扇貝(Pectenyessoensis)中降解途徑為AMP→AdR→HxR；劉亞[20]對馬氏珠母貝(Pinctadamartensi)檢測時，認為其降解途徑為AMP→IMP→HxR和AMP→AdR→HxR。

試驗在縊蟶和文蛤體內檢測到了IMP和AdR，都未檢測到Ad，根據降解產物推測， AMP可能的分解途徑為AMP→IMP→ HxR和AMP→AdR→ HxR。AMP經AMP脫氨酶作用，水解脫氨轉變為IMP，再經核苷酸酶催化成HxR；或AMP經核苷酸酶作用，加水脫磷酸生成AdR，AdR在腺苷脫氨酶作用下生成HxR(圖4)。HxR繼而脫去1-磷酸核糖，生成Hx[21]。

圖4　AMP經IMP或AdR生成HxR的結構式變化Fig.4　Chemical structure changes of HxR generated by AMP though IMP or AdR

縊蟶AMP含量下降的同時，IMP和AdR緩慢上升一段后快速下降，在第5～6天， 產物僅為AMP，IMP、AdR、HxR，AMP下降的含量為0.274 μmol/g與IMP、AdR和HxR上升的總量0.272 μmol/g幾乎相同。可推測AMP降解成了IMP、AdR和HxR。因此縊蟶的AMP降解途徑為： AMP→IMP→HxR和AMP→AdR→HxR。

文蛤AMP含量在第2天由峰值快速下降，同時AdR出現，并快速上升，第4天AMP的下降速率減慢，AdR的上升速率也變慢(圖3)，說明AMP與 AdR的變化可能存在相關性，AdR是由AMP分解成的產物。HxR的含量較少，Hx的含量較多，推測AdR經HxR快速變為Hx，這種現象可能與文蛤中的腺苷脫氨酶及核苷磷酸化酶的活性較強有關[22]。由于在文蛤中檢測到極少量的IMP，AdR最大值遠大于IMP，所以文蛤核苷酸的降解途徑雖為2條，但以AMP→AdR→HxR為主。

2.3鮮度評價

魚類中核苷酸分解途徑是ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，隨著鮮度下降，反應向右進行，但是ATP及分解產物的總量基本恒定。K值[23]是后期產物與ATP分解產物總量的百分比，隨著腐敗程度加深，后期產物含量增多，K值變大，鮮度變小，由此來反映魚類的鮮度。

(2)

計算縊蟶和文蛤8種ATP關聯產物的總量，發現ATP，ADP、AMP、IMP、AdR、HxR、Hx和Xt的總量基本恒定，后期略有下降，其中2種貝類的Xt含量較高，最高可占ATP關聯物總量的29%，因K值中不包括AdR和Xt，所以對K值進行補充，計算經過AdR和Xt修正的Kax值。

(3)

當2種貝類的感官評分在5～4分(新鮮可食)，Kax值基本為0%，感官評分為3時(不可食用)，此時Kax值都約為35%，后期當感官評分為2～0分(腐敗)時，Kax值在50%～100%范圍內,Kax值越大，鮮度越小。TVB-N值與蛋白質分解以及細菌繁殖有關，低溫貯藏會抑制細菌的大量繁殖，但后期由于內外環境作用，TVB-N含量迅速增加。縊蟶和文蛤的TVB-N一品級最大值為10.8。2種貝類在此范圍內的Kax值均為0%～20 %，同時將2種貝類Kax值的變化趨勢與相應的感官評分和TVB-N進行相關性計算(圖5，圖6)，發現縊蟶Kax值與感官評分、TVB-N值的相關系數分別為-0.987，0.989(P<0.01)，文蛤分別為-0.968，0.926(P<0.01)，說明Kax值與感官評分、TVB-N均存在極顯著相關性，Kax值能夠反映縊蟶和文蛤的鮮度情況。

圖5　在4 ℃貯藏期間縊蟶和文蛤的Kax和感官評分的變化Fig.5 Changes in Kax and Sensory of Sinonovacula constricta and Meretrix meretrix. during storage at 4 ℃

圖6　在4 ℃貯藏期間縊蟶和文蛤的Kax和TVB-N的變化Fig.6　Changes inKax and TVB-N of Sinonovacula constricta and Meretrix meretrix. during storage at 4 ℃

3　結論

試驗通過測定ATP及關聯物的種類及含量變化，推測縊蟶、文蛤核苷酸的代謝途徑有2條：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx→Xt和ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx→Xt。文蛤主要以后者AMP→AdR→HxR進行代謝。

Kax值的變化與感官評分和TVB-N值均存在極顯著相關性，Kax指標可用于縊蟶和文蛤的鮮度評價。

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Changes of ATP- related compounds and degradation pathways inSinonovaculaconstrictaandMeretrixmeretrixduring chilled storage

WANG Dan-ni, QIU Wei-qiang, CHEN Shun-sheng*, SONG Xue

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306,China)

The changes of ATP-related compounds and freshness evaluation were investigated inSinonovaculaconstricta,Meretrixmeretrixduring 4 ℃storage. The investigation was performed using HPLC- DAD. Nine kinds of compounds were identified: adenosine triphosphate (ATP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine monophosphate (AMP), inosinic acid (IMP), adenosine (AdR), inosine (HxR), hypoxanthine (Hx), xanthine (Xt), adenine (Ad). It was found that initial values of ATP in two shellfish samples stored at 4 ℃ were 1.033 μmol/g，0.824 μmoL/g, respectively. However, they were rapidly declined at the beginning of the four day, and then the decrease was slowed down. ADP were declining, AMP, IMP, AdR, HxR all showed first increased and then decreased. Xt were rising. Hx inS.constrictawere rising but inM.meretrixwas first increased and then decreased. Ad were not detected in two shellfishes.M.meretrixhad little IMP. According to changes in ATP-related compounds, it was speculated the degradation pathways of two shellfishes might be: ATP → ADP → AMP → IMP → HxR → Hx→ Xt , ATP → ADP → AMP → AdR → HxR → Hx → Xt. Combined with sensory evaluation and TVB-N，Kax-value was highly significantly correlated with sensory scores and TVB-N values. Kax-value could be used to review the fresh degree of two species of shellfishes.

Sinonovaculaconstricta;Meretrixmeretrix; ATP-related compounds; degradation pathway; high performance liquid chromatography(HPLC)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609039

碩士研究生(陳舜勝教授為通訊作者,E-mail：sschen@shou.edu.cn)。

國家自然科學基金資助項目(No.31471685)；上海市科委工程中心建設：上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心(11DZ2280300)；上海海洋大學科技發展專項(A2-0209-15-200008)

2015-12-22，改回日期：2016-03-03