歐盟新型植物育種技術的研究及監管現狀

楊艷萍 董瑜 邢穎 袁建霞

（中國科學院文獻情報中心，北京 100190）

歐盟新型植物育種技術的研究及監管現狀

楊艷萍 董瑜 邢穎 袁建霞

（中國科學院文獻情報中心，北京 100190）

近年來多種具有較大應用前景的新型植物育種技術，如寡核苷酸定點誘變、鋅指核酸酶技術、同源轉基因技術、RNA介導的DNA甲基化、反向育種、轉基因砧木嫁接和農桿菌浸潤等在歐洲發展迅速。這些新技術比常規育種技術更具特異性和針對性，可為育種家提供準確和有效的方法。文獻計量學研究表明，農桿菌浸潤和RNA介導的DNA甲基化等技術在歐盟研究中使用率較高；德國、英國是歐盟新型植物育種技術研究的重要國家。目前，歐盟正在討論由這些新技術產生的植物是否屬于其監管體系，尤其是2001/18/EC指令中定義的轉基因生物。相關機構也紛紛發布一系列報告，對新技術產生的植物及產品的分類監管問題進行了廣泛討論。歐洲食品安全局分別對同源轉基因（cisgenesis/Intragenesis）和鋅指核酸酶（ZFN-3）等技術產生的植物進行風險評估，并認為Cisgenesis與常規育種技術植物的風險程度相當，Intragenesis和常規轉基因技術獲得的植物均可能造成新風險；ZFN-3技術比常規轉基因技術具有更小的風險。

歐盟；新型植物育種技術；轉基因生物；監管

近年來，分子生物學和生物技術的快速發展催生了一批新型植物育種技術。與隨機突變的常規育種技術相比，這些新技術更具特異性和針對性，能精確改變基因組特定位點的遺傳信息，如在特定位置插入、敲除或替換DNA，以及在保持DNA序列不變的情況下控制基因的表達［1］。與常規轉基因技術相比，新技術與其有類似的特征，但嚴格意義上來說兩者并不完全相同，如許多新技術中的轉基因載體僅是瞬時出現或只出現在育種的中間過程而最終商業品種不含外源轉基因元件；或者能夠在指定位置導入基因，可以減少隨機插入導致的不可預知的表達［2］。歐盟及其成員國的多個重要機構和組織，如歐洲聯合研究中心（JRC）、荷蘭遺傳修飾委員會（COGEM）、英國環境釋放咨詢委員會（ACRE）等，非常關注新型植物育種技術（NPBT）的發展及相應的監管問題，相繼發布了一系列報告對新型植物育種技術發展應用、監管分類及風險評估等問題進行了探討［3-6］。本文總結了上述報告中新型植物育種技術的研究進展及歐盟各國對于各類新型植物育種技術的監管建議，以期為我國相關工作提供參考。

1 新型植物育種技術種類及應用

目前，歐盟關注的應用前景較大的新型植物育種技術共有4大類7種技術［7，8］。

1.1 位點特異性誘變技術

包括寡核苷酸定向誘變（ODM）和鋅指核酸酶（ZFN）。這些技術可應用于位點特異的基因敲除、基因功能修飾或外源DNA的定向插入。其中，ODM可通過細胞自身的修復機制對植物基因組中靶序列進行位點特異性替換、插入或缺失。ZFN可通過非同源末端連接或同源重組方式對特異位點進行修復，使植物基因組產生堿基突變、核苷酸缺失/插入。根據其用途，ZFN又可分為兩類：一類是引發特定位點特異性突變技術，如ZFN-1和ZFN-2；另一類是定向整合或替換外源基因技術，如ZFN-3。目前位點特異性誘變技術已應用于商業化育種。美國Cibus公司的基因定向誘變技術（Rapid trait development system，RTDSTM）已被美國農業部認證為非轉基因技術，該公司已利用這項技術培育出抗SU除草劑的油菜新種質；陶氏益農公司利用鋅指核酸酶技術獲得了耐除草劑玉米，并于2010年被美國農業部解除轉基因管制審批［9］。

1.2 同源轉基因技術

包括Cisgenesis和Intragenesis。兩者區別在于供體DNA來源的不同，前者的供體DNA序列包含了導入基因自身的啟動子、內含子和終止子等元件；而后者為自身物種或雜交親和物種的不同遺傳元件在體外重組產生的新基因。該技術已被廣泛應用于多種作物中進行特定性狀改良。歐盟批準了4個新品種，如高支鏈淀粉馬鈴薯、抗晚疫病馬鈴薯、抗黑星病蘋果和高植酸酶活性大麥進行大田試驗，美國也批準了改良加工品質的馬鈴薯開展大田試驗。此外，荷蘭Avebe公司和美國辛普勞公司分別向歐盟和美國遞交了解除高支鏈淀粉馬鈴薯Modena和低丙烯酰胺馬鈴薯的轉基因監管申請［10］。

1.3 陰性植株分離技術（negative segregant technique）

包括RNA介導的DNA甲基化（RdDM）和反向育種。這些技術僅在育種中間過程涉及轉基因技術，轉入的外源基因在進一步的選育中被剔除，最終商業品種中不含任何遺傳修飾相關的DNA序列。其中，RdDM主要通過轉入與目標基因啟動子區域同源的RNA編碼基因，誘導靶基因啟動子區域的甲基化，并通過抑制靶基因的轉錄引發基因沉默。反向育種技術是利用RNAi技術抑制植物減數分裂重組快速獲取純合親本系，以保持植物雜種優勢的穩定遺傳。目前，RdDM技術主要應用于煙草、擬南芥等模式植物和水稻、玉米、馬鈴薯等作物相關基因的修飾和調控研究。反向育種技術相關的研究報道較少，主要應用于模式植物擬南芥的研究中，在作物中的應用仍處于基礎研究階段［3］。

1.4 其他技術

包括農桿菌浸潤和轉基因砧木嫁接。農桿菌浸潤技術又可分為狹義的農桿菌浸潤和農桿菌注射，前者是將葉片浸潤于非復制型載體的農桿菌懸浮液中，以研究局部的基因定位表達；后者主要將葉片浸潤于含有病毒載體的農桿菌懸浮液中，以研究目標基因在整個植株中的表達和擴散。轉基因砧木嫁接技術是將非轉基因接穗嫁接在具有改良特性（如根系能力改善、抗土傳病害）的轉基因砧木上，以改良作物的特定性狀。目前，農桿菌浸潤技術主要應用于模式植物煙草的基礎研究，也有公司利用該技術研究如馬鈴薯、油菜和萵苣等作物。轉基因砧木嫁接技術主要應用于果樹、蔬菜等作物育種中，相關品種目前在歐盟申請了大田試驗，分別為增強生根力的蘋果和梨、抗扇葉病的葡萄、抗疫病的柑橘以及改善株型的枳橙［3］。

2 歐盟各國新型植物育種技術研究現狀

文獻是反映科技發展趨勢的重要載體，科技文獻數量和結構的變化能夠客觀反映相應的科學技術領域的發展特征［11］。本文利用新型植物育種技術相關的關鍵詞［3］從ISI Web of Science數據庫對歐盟各國發表的論文進行檢索，共得到541篇文獻（論文檢索時間為2015年5月）。其中，7種新型植物育種技術在歐盟均有研究，尤其在2000年以后相關文獻數量呈快速增長趨勢，說明該領域的研究活動逐漸活躍（圖1）。從時間上看，2000年前出現的較早技術依次為農桿菌浸潤、ODM、轉基因砧木嫁接和RdDM；2004年以后出現的新技術分別為同源轉基因技術、ZFN和反向育種技術。從每年的文獻數量看，農桿菌浸潤技術和RdDM為歐盟研究使用頻率較高的技術；ZFN是近年來較活躍的新技術。

圖1 1986-2015年歐盟新型植物育種技術論文的時間分布

表1中顯示了歐盟新型植物育種技術論文數量排名前10的國家。從發文數量看，排名前5的國家分別為德國、英國、法國、荷蘭和西班牙，并且德、英和法等國家的研究幾乎涵蓋了7種技術。從技術種類看，RdDM和農桿菌浸潤等技術在排名前10的國家中均有分布；同源轉基因技術為荷蘭的優勢技術；ZFN和ODM的研究主要集中在德國；反向育種技術為研究使用最少的技術。

對歐盟各國研究機構的分析表明，發文量排名前5的機構分別為荷蘭瓦赫寧根大學、法國國家農業科學院（INRA）、英國John Innes Centre（JIC）、奧地利科學院和德國馬普研究所。其中，瓦赫寧根大學的研究主要涉及了同源轉基因和農桿菌浸潤技術；法國國家農業科學院（INRA）的研究覆蓋了7種新技術；英國JIC和奧地利科學院等機構的研究分別較多涉及了農桿菌浸潤和RdDM技術（表2）。

3 新型植物育種技術及其產品的監管現狀

隨著技術的發展，新型植物育種技術與常規轉基因技術之間的界限越來越模糊，對轉基因生物（GMO）法律解釋的不同理解會使新型植物育種技術產品產生不同的分類結果（轉基因或非轉基因）。此外，對于新技術作物在立法、定義和監管方法等方面的差異，還會導致監管方法的不統一和這些作物及相關市場貿易發展的不同步。因此，歐盟及其成員國紛紛圍繞新型植物育種技術作物是否符合歐盟2001/18/EC指令中GMO的法律解釋等問題展開了深入探討。

表1 新型植物育種技術論文排名前10的歐盟成員國分布情況/篇

表2 新型植物育種技術論文排名前10的歐盟研究機構分布情況

JRC邀請了阿根廷、澳大利亞、加拿大、日本、南非和美國等國專家參與討論對于新型植物育種技術的管理和立法［12］；英國ACRE從3個角度對新育種技術相關產品是否屬于GMO進行了分析，包括是否使用轉基因技術、中間產品是否屬于GMO、后代是否為GMO［4］；德國栽培作物研究中心（JKI）和荷蘭COGEM等機構分別組織專家討論相關問題［13-16］。但因新技術的多樣性和作用方式的復雜性以及研究進展的不同步等因素，各機構無法獲得完全相同的結論。目前多數觀點認為同源轉基因、ZFN-3、轉基因砧木等技術獲得的含有重組DNA的植株及后代需要監管；ODM、ZFN-1、反向育種等技術產生的后代為非轉基因生物；RdDM則需根據其是否改變植物基因組DNA做判斷；轉基因砧木嫁接技術需區分砧木與后代的監管；農桿菌浸潤技術視具體情況而定，無重組DNA的后代無需監管（表3）。

4 新型植物育種技術的監管原則

由于新型植物育種技術出現和發展的時間較短，目前對于新型植物育種技術是否對人類健康和環境存在潛在風險還不清楚（或者認識還不一致），因此是否和如何評估新技術的潛在風險成為歐盟關注的重點之一。有觀點認為，用于轉基因作物風險評估的法規和原則也適用于評估新型植物育種技術的潛在風險［2］；但也有觀點認為，風險評估必須基于證據基礎，關注性狀和產品而不是技術本身，應根據新技術的各自特點進行評估，并且需要將最終產品與中間品系區別對待［1，6，17-19］。

COGEM認為反向育種技術的產品與常規育種產品一樣安全而無需進行風險分析；對于農桿菌浸潤技術，需要了解農桿菌浸染植株后代有關的風險；對于RdDM，無法根據現有知識對其風險進行評估；對于轉基因砧木嫁接技術，建議根據公認的方法對其環境風險進行評價；對于ODM，認為其比非定向誘變的風險更低［5］。歐洲食品安全局（EFSA）對同源轉基因技術和ZFN-3技術的安全性評估結果認為，歐盟現有轉基因生物風險評估指導條例適用于上述新技術及其產品的風險評估；其中，Cisgenesis與常規育種技術的風險程度相當，Intragenesis和常規轉基因技術均可能造成新風險；ZFN-3技術比常規轉基因技術具有更小的風險［20，21］。奧地利衛生及食品安全局也對同源轉基因技術開展了風險評估，并獲得了與EFSA相似的結論［22］。

表3 歐盟機構對于新型植物育種技術的監管分類結果

5 對我國的啟示

我國新型植物育種技術發展迅速，已將定點誘變、同源轉基因、轉基因砧木嫁接等多種新技術陸續應用于基礎研究中［23-27］。隨著這些新技術及其成果在育種中的應用，在不久的將來我國也會面臨監管制度無法適應技術發展的問題。雖然我國在《農業轉基因生物安全管理條例》中將農業轉基因生物確定為“利用基因工程技術改變基因組構成，用于農業生產或者農產品加工的動植物、微生物及其產品”，但該規定對于“新型育種技術及產品是否屬于轉基因生物”等問題沒有明確規定。因此，新型植物育種技術及產品是否需要監管以及如何監管等問題應引起我國政府的重視。為此建議國家相關部門積極應對、未雨綢繆，組織相關專家開展研討以明確其法律地位，最終促進這些新技術的快速發展與合理應用，這對于保障國家糧食安全和我國農業產業的可持續發展具有重要戰略意義和實用價值。

［1］ 英國生物技術和生物科學研究理事會（BBSRC）網站. BBSRC'S POSITION STATEMENT ON NEW CROP BREEDING TOOLS. http：//www. bbsrc. ac. uk/news/policy/2014/141028-prposition-statement-on-crop-breeding-techniques/（2014年10月）［2015年4月］.

［2］ 奧地利聯邦衛生部網站. New plant breeding techniques. http：// www. bmg. gv. at/home/Schwerpunkte/Gentechnik/Fachinformation_ Gruene_Gentechnik/Studie_New_plant_breeding_techniques_（2014年2月）［2015年4月］.

［3］ 歐盟聯合研究中心（JRC）網站. New plant breeding techniques. State-of-the-art and prospects for commercial development. http：// ipts. jrc. ec. europa. eu/publications/pub. cfm？id=4100（2011年5月）［2014年2月］.

［4］ 荷蘭遺傳修飾委員會（COGEM）網站. New techniques in plant biotechnology. http：//www. cogem. net/index. cfm/en/publications/ publicatie/new-techniques-in-plant-biotechnology（2006年10月）［2014年2月］.

［5］ 荷蘭遺傳修飾委員會（COGEM）網站. Novel plant breedingtechniques. http：//www. cogem. net/index. cfm/en/publications/ publicatie/novel-plant-breeding-techniques（2009年12月）［2014年2月］.

［6］ 英國環境釋放咨詢委員會（ACRE）網站. ACRE advice：New techniques used in plant breeding. https：//www. gov. uk/ government/organisations/advisory-committee-on-releases-to-theenvironment（2013年8月）［2014年2月］.

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［9］ Ledford H. US regulation misses some GM crops［J］. Nature，2013， 500（7463）：389-390.

［10］ Holme IB， Wendt T， Holm PB. Intragenesis and cisgenesis as alternatives to transgenic crop development［J］. Plant Biotechnology Journal， 2013， 11（4）：395-407.

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［12］ 歐盟聯合研究中心（JRC）網站. Comparative regulatory approaches for new plant breeding techniques - Workshop Proceedings. http：//ipts. jrc. ec. europa. eu/publications/pub. cfm？id=4959（2012年2月）［2014年2月］.

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［15］ 荷蘭遺傳修飾委員會（COGEM）網站. Should EU legislation be updated？ Scientific developments throw new light on the process and product approaches. http：//www. cogem. net/index. cfm/en/publications/publicatie/should-eu-legislation-be-updatedscientific-developments-throw-new-light-on-the-process-andproduct-approaches（2009年6月）［2015年4月］.

［16］ 荷蘭遺傳修飾委員會（COGEM）網站. Zinc finger on the pulse：Developments and implications of zinc finger technology. http：//www. cogem. net/index. cfm/en/publications/publicatie/zincfinger-on-the-pulse-developments-and-implications-of-zinc-fingertechnology. （2009年6月）［2015年4月］.

［17］ 歐洲科學院科學咨詢理事會（EASAC）http：//www. easac. eu/fileadmin/Reports/Planting_the_Future/New_breeding_techniq ues_-_EASAC_statement_July12. pdf（2012年7月）［2014年2月］.

［18］ 歐洲植物科學組織（EPSO）網站. On New Breeding Techniques - Ensuring an Innovative and Diversified European Agriculture. http：//www. epsoweb. org/file/1096（2012年9月）［2014年2月］.

［19］ 歐洲植物科學組織（EPSO）網站. Crop Genetic Improvement Technologies. http：//www. epsoweb. org/file/2038（2015年2月）［2015年4月］.

［20］ EFSA. Scientific opinion addressing the safety assessment of plants developed through cisgenesis and intragenesis［J］. EFSA Journal， 2012， 10（2）：2561：1-33.

［21］ EFSA. Scientific opinion addressing the safety assessment of plants developed using Zinc Finger Nuclease 3 and other Site-Directed Nucleases with similar function［J］. EFSA J， 2012， 10：2943：1-31.

［22］ 奧地利聯邦衛生部網站. Cisgenesis - A report on the practical consequences of the application of novel techniques in plant breeding. http：//bmg. gv. at/home/Schwerpunkte/Gentechnik/ Fachinformation_Gruene_Gentechnik/Cisgenesis_A_report_ on_the_practical_consequences_of_the_application_of_novel_ techniques_in_plant_breeding（2012年10月）［2015年4月］.

［23］ Shan Q， Wang Y， Li J， et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system［J］. Nature Biotechnology，2013， 31（8）：686-688.

［24］ Shan Q， Wang Y， Li J， et al. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system［J］. Nat Protoc， 2014， 10：2395-2410.

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（責任編輯 馬鑫）

The Research and Regulatory Status of Novel Plant Breeding Techniques in Europe

YANG Yan-ping DONG Yu XING Ying YUAN Jian-xia
（National Science Library of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190）

Recently， a number of novel plant breeding techniques（NPBTs）with great application prospect， such as oligonucleotide directed mutagenesis（ODM）， zinc finger nuclease（ZFN）technology， cisgenesis/intragenesis， RNA-dependent DNA methylation（RdDM），reverse breeding， grafting（on GM rootstock）， and agro-infiltration， have been developed rapidly in Europe. These techniques are more specific and targeted than conventional breeding methods， and thereby can provide more precise， rapid and efficient methods for breeders. The results from literature metrology showed that agro-infiltration and RdDM were the most commonly used techniques in EU， and Germany and the UK were the leading countries on the research of NPBTs. To date， it is being discussed whether the plants produced by these new techniques are captured by the EU's GMO legislation， in particular directive 2001/18/EC. In the abundant reports published by relevant organizations， the classification and supervision of plants and products generated by NPBTs were extensively discussed. The risk assessment of plants by ZFN-3 and Cisgenesis/ intragenesis was carried out by the European Food Safety Authority（EFSA）respectively. It was concluded that plants by cisgenesis had similar hazards with that produced by conventional breeding， whereas novel hazards might arise with intragenic and transgenic plants. In addition， the panel suggested that there would be fewer hazards for plants of ZFN-3 than conventional GMOs.

EU；new plant breeding techniques；GMO；regulatory

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.032

2015-05-05

楊艷萍，女，博士，研究方向：農業科技情報；E-mail：yangyp@mail.las.ac.cn

董瑜，女，碩士，研究方向：農業科技情報；E-mail：dongy@mail.las.ac.cn