一株新的染料甲基紅降解菌株Paracoccus sp. L-4的分離、鑒定及其脫色特性研究

陳亮 王莉

（安徽建筑大學環境與能源工程學院，合肥 230601）

一株新的染料甲基紅降解菌株Paracoccus sp. L-4的分離、鑒定及其脫色特性研究

陳亮 王莉

（安徽建筑大學環境與能源工程學院，合肥 230601）

從副球菌屬首次分離到一株有較強甲基紅降解能力的菌株Paracoccus sp. L-4，在LB培養基中，16 h內使100 mg/L培養液甲基紅降解掉91.74%，2 d 內可使甲基紅降解率近達100%。該菌株降解甲基紅適宜的溫度和pH值范圍分別為25-30℃、pH6.0-7.0，Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+對甲基紅的降解有明顯抑制作用。菌株L-4在好氧和缺氧條件均能較好降解甲基紅，裝液量≤100 mL時脫色率隨裝液量增加而減少，裝液量≥125 mL時，12 h時降解率仍大于40%。菌株L-4在染料廢水的生物處理方面有一定的應用價值。

甲基紅；Paracoccus sp. L-4；分離；鑒定；降解特性

偶氮染料是目前使用量最大的一類合成染料，因其成本低廉和染色性能突出等優點被廣泛應用于紡織、皮革、食品和化妝品等行業。偶氮染料具抗光、抗氧化能力，故能穩定存在于水體，造成水體色度增加，并影響水生生物的生存［1，2］。據報道，多數偶氮染料及其代謝的中間產物具致癌、致畸和致突變等毒害作用［3，4］。因此，偶氮染料引起的水污染問題一直是國內外關注的焦點。

廢水的生物處理法具有高效、安全、低能耗以及環境友好等特點［5，6］。迄今為止，已分離篩選出許多可使偶氮染料降解脫色的微生物，其中一些成功應用于染料廢水的生物修復［7-9］。而有關偶氮染料甲基紅的降解脫色菌株的研究一直較少有人涉及。本研究報道一株對甲基紅有較好降解能力的菌株副球菌屬Paracoccus sp. L-4，詳細摸索菌株L-4的生理生化和降解特性，以期為該菌株應用偶氮染料廢水的處理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

污泥取自江蘇常熟某染料化工廠排污口。

LB（Luria-Bertani）培養基：10.0 g蛋白胨，5.0 g酵母浸粉，10.0 g NaCl，1 000 mL水，pH 7.0-7.2。1/10 LB培養基：1.0 g蛋白胨，0.5 g酵母浸粉，1.5g NaCl，1.0 g NH4NO3，1.5 g K2HPO4·H2O，0.5 g KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，1 000 mL水，pH 7.0-7.2。無機鹽培養基（Mineral salt medium，MSM）：1.0 g NH4NO3，1.5 g K2HPO4·H2O，0.5 g KH2PO4，0.5 g NaCl，0.2 g MgSO4·7H2O，1 000 mL水，pH 7.0-7.2。甲基紅為分析純，購自天津市化學試劑三廠。二氯甲烷為分析純，購自上海中試化工總公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集與分離 將5.0 g污泥置于50 mL含20 mg/L甲基紅的1/10 LB培養基中，30℃、170 r/min振蕩培養。每隔1周轉接1次，甲基紅逐漸提高的濃度至100 mg/L。經測定，連續3代能降解甲基紅達85%以上的即為穩定富集液。將富集液梯度稀釋后涂布于含100 mg/L甲基紅的LB平板。挑取有無色透明圈的單菌落接種到液體LB，采用紫外可見分光光度法檢測其甲基紅的降解脫色能力。

1.2.2 菌株的鑒定 降解菌株的形態和生理生化特性參照文獻［10］進行。菌株總DNA的提取采用高鹽法，并以此作為模板進行16S rDNA基因的擴增。PCR產物經上海生工生物工程有限公司測序，測序結果通過在線分析，與GenBank中的其他16S rRNA基因序列進行相似性比較，構建系統進化樹。

1.2.3 菌株 L-4 對甲基紅的降解 在50 mL LB、MSM中分別添加100 mg/L甲基紅，接種0.5 mL預培養的L-4種子液（OD600nm=1.0），觀察L-4對甲基紅的降解。30℃、170 r/min搖床振蕩培養，間隔時間取樣，測定培養液中甲基紅的殘留量。菌株的生長用OD600nm表示。

1.2.4 環境條件對菌株 L-4 降解甲基紅的影響在50 mL LB中添加100 mg/L甲基紅，接種L-4后，分別在不同條件下170 r/min振蕩培養后測定甲基紅的降解脫色情況，觀察溫度、初始pH值、通氣量和金屬離子對菌株L-4甲基紅脫色的影響。12 h后取樣，測定培養液中甲基紅的殘留量。所有處理設3個重復。

1.2.5 染料濃度對菌株 L-4 降解甲基紅的影響 在50 mL LB中添加甲基紅至終濃度分別為50、100、150、200、250、300、350和400 mg/L，30℃、170 r/min 搖床振蕩培養。接種菌株2 d后，測定培養液中甲基紅的殘留量。所有處理設3個重復。

1.2.6 甲基紅含量的測定 培養液以12 000 r/min離心5 min，收集上清液。加入3倍體積的二氯甲烷，劇烈振蕩5 min，靜置10 min分層。用尖嘴吸管吸取下層有機相，加入少量無水硫酸鈉。取1.0 mL置1.5 mL離心管，室溫氮氣吹干。加入3 mL二氯甲烷溶解，于島津 UV-1800 紫外可見分光光度計檢測培養液中的甲紅紅殘留量。甲基紅檢測波長分別為420 nm。

2 結果

2.1 降解菌株L-4的分離和鑒定

采用富集培養的方式，從長期受染料污染的污泥中分離到一株能夠較好對甲基紅降解脫色的細菌菌株，命名為L-4。該菌株在含有100 mg/L甲基紅的50 mL 1/10 LB中，2 d對甲基紅的降解率近達100%。

菌株L-4在LB平板上生長2 d后，菌落呈乳白色、圓形、光滑、黏稠。菌株L-4為革蘭氏陰性菌，不運動，不能形成芽孢，呈短桿狀（0.8-0.9 μm×0.9-1.1 μm）。菌株L-4氧化酶、過氧化氫酶、α-葡糖苷酶、硝酸鹽還原反應陽性，α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶和脲酶陰性。能利用L-阿拉伯糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖、D-甘露糖醇、D-核糖和D-蔗糖作為唯一碳源生長。菌株L-4能耐4%的NaCl。

提取降解菌基因組DNA，用16S rDNA 通用引物對降解菌的16S rDNA進行擴增，得到長度約為1 329 bp的片段。將測序結果提交至NCBI數據庫獲得登錄號。根據L-4與相關屬種16S rRNA序列構建系統進化發育樹（圖 1），比較發現，菌株L-4與Paracoccus limosus同源性達97.8%，與該屬Paracoccus denitrificans、Paracoccus marinus和 Paracoccus aminophilus也分別有 97.7%、97.7% 和97.4% 的相似性。因此，結合菌株形態和生理生化特征，將L-4歸屬到副球菌屬（Paracoccus sp.）。

圖1 降解菌株 L-4 的系統發育樹

2.2 菌株L-4對甲基紅的降解脫色

由圖2可知，菌株L-4不能以甲基紅為唯一的碳源生長和降解甲基紅，36 h時MSM培養基中L-4的OD600nm值未見明顯增加，甲基紅質量濃度也未見明顯減少。但在LB培養基中，L-4 表現出較強的降解能力，16 h時培養液甲基紅質量濃度已從97.11 mg/L下降至8.02 mg/L，降解率達91.74%，相應菌液的OD600nm值也從0.02上升至1.24。

圖2 L-4以甲基紅為碳源的生長和降解

2.3 溫度對菌株L-4降解甲基紅的影響

菌株L-4在不同溫度降解甲基紅結果（圖3）顯示，當溫度為25、30℃時，菌株對甲基紅有較好的脫色能力，12 h時培養液甲基紅的降解率分別為65.84%、78.89%，30℃為最適溫度。在20℃及以下和35℃及以上，脫色效果較差，脫色率小于37%。

圖3 溫度對L-4降解甲基紅的影響

2.4 初始pH值對菌株L-4降解甲基紅的影響

菌株L-4在不同pH下降解甲基紅結果（圖4）顯示，該菌在過酸（pH4-5）或過堿（pH8-9）條件下都不能很好地降解甲基紅，12 h時甲基紅降解脫色率小于21%。菌株L-4降解甲基紅適宜pH值范圍為6.0-7.0，12 h時甲基紅降解率超過80%，pH6.0的降解效果最佳，脫色率達88.08%。

圖4 pH值對L-4降解甲基紅的影響

2.5 通氣量對菌株L-4降解甲基紅的影響

本實驗以不同的裝液量來反映通氣量對菌株L-4降解甲基紅的影響，結果如圖5所示。當裝液量≤125 mL時，脫色率隨著裝液量的增加而減少，且裝液量對L-4降解甲基紅影響較大；裝液量為25 mL時，降解率達到88.2%，而在125 mL處僅達到47.14%。但裝液量繼續增大時，培養液甲基紅殘留量未見明顯增加，12 h時幾組的甲基紅降解率仍大于40%。

圖5 通氣量對L-4降解甲基紅的影響

2.6 金屬離子對菌株L-4降解甲基紅的影響

菌株L-4在不同pH下降解甲基紅的結果如圖6所示。本實驗觀察Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ca2+和Mn2+幾種離子對菌株L-4降解脫色效果的影響，金屬離子濃度為1 mmol/L。結果表明，Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+7種金屬離子對甲基紅的降解有較強地抑制作用，幾種金屬離子下的甲基紅降解率小于40%。而Mg2+、Ca2+和Mn2+對甲基紅的降解無明顯抑制作用，脫色率分別為78.92%、79.46%和78.79%。

圖6 金屬離子對L-4降解甲基紅的影響

2.7 初始濃度對菌株L-4降解甲基紅的影響

不同初始濃度對菌株L-4降解甲基紅的影響如圖7所示。菌株L-4對甲基紅的脫色率隨甲基紅的初始濃度的升高而降低。當初始質量濃度≤200 mg/L，24 h時，甲基紅脫色率達到90%以上，50 mg/L時脫色率最高，達到98.53%，300 mg/L時，脫色率仍能達到43.35%。與其他偶氮染料降解微生物相比［11-13］，菌株L-4對于高質量濃度甲基紅，具有良好的脫色能力。但當濃度為400 mg/L時，脫色效果不佳，脫色率僅為12.51%，說明此時染料質量濃度可能已經超過了該菌株的耐受能力，降解酶活性受到了較強的抑制作用。

3 討論

隨著印染、紡織等行業的迅速發展，染料廢水逐年增加，其中偶氮染料廢水產量最大。生物法被認為是目前最有前途的一種廢水處理法［5，6］，而生物處理法的關鍵是高效的降解微生物的篩選。到目前為止有大量的偶氮染料脫色微生物從各種環境中被分離出來，而甲基紅降解脫色菌株卻較少見到報道［14-16］。本實驗在長期受染料污染的污泥中分離獲得一株高效降解甲基紅的菌株L-4，該菌株能在16 h內使培養液100 mg/L甲基紅降解率達91.74%，2 d內可使甲基紅的降解率近達100%。

圖7 甲基紅初始質量濃度對L-4降解甲基紅的影響

根據形態學、生理生化特性實驗，將菌株L-4初步歸屬到副球菌屬（Paracoccus sp.），這是首次從副球菌屬分離到有甲基紅降解能力的菌株，因此該菌株的分離豐富了甲基紅降解的菌種資源。已報道的偶氮脫色細菌有好氧菌也有厭氧菌，但即便是好氧菌，脫色仍需厭氧環境［17，18］。本實驗中，菌株L-4的生長和對甲基紅的降解脫色都是在好氧條件下，這可能是因為菌株L-4的細胞存在好氧性的偶氮染料降解脫色酶的緣故，因此，菌株L-4的分離將有助于進一步揭示偶氮染料的好氧脫色機制。

環境條件對菌株降解甲基紅的影響實驗表明，該菌株降解甲基紅的適宜溫度25-30℃，適宜pH值為6.0-7.0，Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+對甲基紅的降解有較強地抑制作用。但通氣量對菌株L-4 影響較小，缺氧條件也可較好地降解甲基紅，12 h時裝液量≥125 mL實驗組降解率仍大于40%，提示菌株L-4在缺氧條件也可較好的對甲基紅降解脫色。

4 結論

分離篩選得到一株能夠有效降解甲基紅的菌株L-4，初步鑒定該菌株為副球菌屬（Paracoccus sp.）。該菌株不能以甲基紅為唯一碳源生長和降解甲基紅，在LB培養基中，16 h內使100 mg/L培養液甲基紅降解掉91.74%，降解甲基紅的適宜溫度為25-30℃，適宜pH值為6.0-7.0，裝液量≤100 mL時，脫色率能達到60%，裝液量＞100 mL，也在40%以上，L-4對高質量濃度甲基紅具有良好的脫色能力，24 h，50 mg/L時，脫色率最高，達到98.53%。部分金屬離子對該菌株降解甲基紅有抑制作用，其中其中Cu2+抑制最明顯，12 h，甲基紅的降解率僅為30.07%。

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（責任編輯 李楠）

Isolation，Identification and Decolonization Characteristics of a New Methyl Red Degrading Bacterial Strain Paracoccus sp. L-4

CHEN Liang WANG Li
（College of Environment and Energy Engineering，Anhui University of Architecture，Hefei 230601）

The strain Paracoccus sp. L-4 was isolated from Paracoccus sp. at first time， and it had the strong ability to degrade methyl red. In LB medium， methyl red in the concentration of 100 mg/L was degraded 91.74% in 16 h， and approximately 100% in 2 d. Furthermore，the optimal conditions for degrading methyl red were 25-30℃ and pH6.0-7.0， respectively. And Zn2+， Co2+， Cu2+， Ag+， Al3+， Fe3+and Fe2+had an significant inhibitory effects on the degradation of methyl red. The degradation and decolorization of methyl red by strain L-4 was performed well in both aerobic and anoxic conditions. When the volume of liquid was ≤ 100 mL， the ratio of decolorization decreased with the increase of volume of liquid. However， when the amount of liquid was ≥ 125 mL， the degradation rate of methyl red was still over 40% at 12 h， indicating that strain L-4 has a potential application value in biological treatment of dye wastewater.

methyl red；Paracoccus sp. L-4；isolation；identification；degradation characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.019

2015-04-09

國家自然科學基金項目（21107002）

陳亮，男，碩士研究生，研究方向：偶氮類染料的微生物降解；E-mail：1028383665@qq.com

王莉，女，副教授，研究方向：染料的微生物降解；E-mail：642012688@qq.com