草酸青霉菌生產纖維素酶的反應條件優化

李洋 高曉蓉 張健

（大連理工大學生命科學與技術學院，大連 116024）

草酸青霉菌生產纖維素酶的反應條件優化

李洋 高曉蓉 張健

（大連理工大學生命科學與技術學院，大連 116024）

纖維素酶在生物能源、紡織、飼料和造紙工業等具有重要作用，篩選高效微生物生產菌株，優化最佳產酶工藝，是獲得該產品的有效途徑。從含有落葉腐木和腐爛秸稈的土壤中篩選出一株高效纖維素降解菌，采用形態學觀察及核糖體保守序列分析確定該菌株分類地位，對菌株最適發酵初始pH、最適碳源、氮源及不同表面活性劑選擇添加進行最佳產酶條件優化。形態學結合ITS（Internal Transcribesd Spacer）基因序列系統發育學分析確定分離的菌株其為草酸青霉菌，命名為Penicillium oxalicum JG。該菌株以初始pH2.0-3.0，CMC-Na為碳源，豆粉為氮源時，產纖維素酶能力達到最大。不同表面活性劑對菌株產酶影響的結果發現，來源廣泛、價格相對較低廉的卵磷脂對草酸青霉菌具有明顯的產酶促進作用，發酵液中濾紙酶（FPA）、β-1，4-內切葡聚糖酶（CMCase）和β-葡萄糖苷酶（BGL）活力分別提高72.9%、20.8%和33.6%。草酸青霉菌JG可在酸性初始條件下發酵生產復合纖維素酶，卵磷脂可明顯提高其產酶活性。

草酸青霉菌；纖維素酶；卵磷脂；條件優化

每年植物通過光合作用產生的木質纖維素類物質約7.2 ×1010t，如此大量的生物質可以為人類的可持續發展提供豐富的再生能源［1］。但是由于結構的特殊性，木質纖維素的利用一直受到限制［2］。微生物生產的纖維素酶能夠把纖維素降解成小分子糖，進一步發酵生產能源類物質［3，4］。目前工業上用于纖維素酶生產的菌種主要是各種真菌，包括木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）等［5］，但不同菌株的最佳產酶條件和促進劑作用多有不同，每種菌株所產纖維素酶若不能發揮其全部潛能，將嚴重影響纖維素酶的降解效率［6，7］。本實驗從腐殖土壤樣品中分離一株產纖維素酶降解菌，通過對其發酵產酶條件優化和產酶組成分析，旨為纖維素酶菌株的生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品 實驗樣品采自大連市不同地區20個含有腐木、腐爛秸稈的土樣及牛糞等。

1.1.2 實驗試劑 化學試劑均為分析純。引物合成及DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.3 培養基組分 羧甲基纖維素鈉培養基：CMCNa 10 g，（NH4）2SO44 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨1.0 g，瓊脂16 g，加水至1 L，1×105Pa滅菌30 min。

纖維素剛果紅鑒別培養基（參照文獻［8］稍有改進）：（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，KH2PO41.0 g，微晶纖維素 2.0 g，剛果紅0.4 g，瓊脂 20 g，加水至1 L，1×105Pa滅菌30 min。

濾紙液體培養基：濾紙 0.5 g，（NH4）2SO420.0 g，尿素 3.0 g，蛋白胨 3.0 g，CaCl23.0 g，MgSO4·7H2O 5.0 g，NaCl 0.1 g，FeSO4·7H2O 50.0 mg，MnSO4·7H2O 16.0 mg，ZnSO4·7H2O 14.0 mg，COCl220.0 mg，加水至1 L，1×105Pa滅菌30 min。

發酵培養基：麩皮 30 g，（NH4）2SO43.0 g，KH2PO42.0 g，加水至1 L，1×105Pa滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 每份土樣10.0 g，加入無菌水，28℃，200 r/min 振蕩培養48 h 后，取上清液。采取梯度稀釋法，按照10-1-10-8濃度分別涂布于羧甲基纖維素篩選培養基上，30℃暗培養3 d。挑取長勢好的菌株轉接到剛果紅培養基，挑選顯示有透明圈的菌株接入PDA 培養基進行純化［9］。純化3代后，接入濾紙液體培養基，30℃，180 r/min 震蕩培養7 d，測試濾紙崩解率［10］。

濾紙崩解率（%）=（發酵前的濾紙條重量-發酵后的濾紙條的重量）/ 發酵前的濾紙條重量×100%

1.2.2 菌株的鑒定 形態、培養和生理生化特征鑒定參照《真菌鑒定手冊》進行。

DNA提取采用Sangon真菌提取試劑盒。以提取的基因組DNA為模板，真菌通用引物ITS1：（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4：（5'-TCCTCGCCTTATTGATATGC-3'）［11］為引物進行PCR擴增，反應體系25 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 2 min，35個循環；72℃延伸10 min。

PCR產物測序由Songon 公司完成。測序結果應用MEGA5.0 軟件包構建系統發育樹［12］。

1.2.3 纖維素酶酶活力測定和定義 分別以1%（W/V）羧甲基纖維素鈉、50 mg（1 cm×6 cm）新華濾紙、0.5%水楊苷為底物，在50℃下分別反應60 min、30 min 和30 min，在540 nm 紫外波長下，用DNS法測定濾紙酶（FPA）、β-1，4-內切葡聚糖酶（CMCase）、β-糖苷酶（BGL）［13］酶活。

酶活定義：在50℃條件下，相應底物在酶的作用下，每分鐘產生1 μmol 葡萄糖所需酶量為一個酶活力單位，用 IU/mL表示［14］。

1.2.4 菌株初始pH、碳源、氮源及金屬離子的確定 將基礎發酵培養基初始pH值分別調至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，測定不同pH條件下菌株產酶活性。分別用麩皮、濾紙、CMC-Na、玉米粉代替基礎發酵培養基中碳源，用豆粉、硫酸銨、尿素、酵母粉、蛋白胨代替氮源，添加不同種類金屬離子，30℃，180 r/min發酵培養144 h，測定不同碳、氮源及金屬離子對菌株酶活的影響［15］。

1.2.5 不同種類表面活性劑對菌株產酶影響 在優化后的培養基中分別加入EDTA二鈉、SDS、PEG、鼠李糖脂及卵磷脂，30℃，180 r/min發酵培養144 h，測定不同表面活性劑對菌株JG產酶的影響［16，17］。

1.2.6 纖維素酶SDS-PAGE分析 菌株JG在優化后的培養基中，30℃，180 r/min 發酵培養144 h，粗酶液經40%乙醇沉淀、濃縮后， 上樣于15%的分離膠和5%的濃縮膠中進行SDS-PAGE電泳，以標準纖維素酶（上海Songon公司）及商品化酸性纖維素酶（山東龍元生物工程有限公司食品添加、紡織用工業酸性纖維素酶）作為對照。

2 結果

2.1 菌株的篩選

選取CMC-Na培養基上長勢良好的10個菌株，分離純化后分別命名為Y-1、JG-1、TNL-1、TNL-2、XTNL-1、HTNL-2、WHXTNL、LZ、JG-2和VI。從菌落生長形態判斷Y-1和VI為放線菌；TNL-1和TNL-2為細菌；JG、XTNL-1、HTNL-2、WHXTNL、LZ和JG為真菌。進一步測試各菌株對濾紙崩解程度發現，JG濾紙崩解率最高，為19.7%。圖1為JG在剛果紅鑒別培養基上產生的透明圈及其在PDA培養基上生長5 d的形態，可以看出菌落呈明顯青綠色，表面為粉粒狀，初步確定JG為真菌。液體培養結果測得，JG的CMCase酶活性為 0.435 IU/mL，明顯高于其他菌株，故選擇JG進一步研究。

圖1 菌株JG形態特征

2.2 菌株ITS序列鑒定及系統發育分析

PCR擴增獲得的序列長度為564 bp，GenBank序列登錄號為KC880081.1，與Penicillium oxalicum strain QHBC11相似性最大，為99%，初步確定該菌株為一株草酸青霉菌，命名為Penicillium oxalicum JG（圖2）。

圖2 菌株JG基因系統發育進化樹

2.3 初始pH對菌株產酶影響

培養基發酵初始pH值對菌株JG產酶活性影響結果（圖3）表明，菌株以麩皮為底物，初始pH在2.0-3.0時，所產纖維素總的酶活性最高，當初始pH＞5.0時，酶活開始明顯下降。在發酵過程中還發現，4.0時該菌產酶最適pH值。

圖3 不同初始發酵的pH值對纖維素酶活影響

2.4 不同碳源對纖維素酶活的影響

發酵初始pH2.5條件下，菌株JG在以CMC-Na和麩皮為底物時，誘導產生的CMCase和BGL均表現出較高的酶活力（表1），外切纖維素酶活也明顯高于其他種類的碳源（表中未列出），但是以CMC-Na為碳源的FPA略低于以麩皮為碳源時的活力。通常情況下，CMCase作為水解纖維素聚合鏈的第一步反應酶，其活力大小起著重要作用，故選取CMCase酶活表現較高的CMC-Na作為JG發酵培養的最適碳源。

表1 不同碳源對纖維素酶活的影響

2.5 不同氮源對菌株纖維素酶活的影響

在發酵初始pH2.5，碳源為CMC-Na的條件下優化氮源的結果（表2）顯示，豆粉作為有機氮源更容易被菌株利用，且對提高菌株酶活力有明顯的促進作用。故選擇豆粉作為發酵培養基的最適氮源。

表2 不同氮源對纖維素酶活的影響

2.6 不同金屬離子對菌株纖維素酶活的影響

金屬離子通常作為酶的活性中心的組成部分，對調節維持微生物細胞滲透壓以及維持細胞結構的穩定性具有重要的作用。在培養基中分別加入Na+、Mg2+、Ca2+、K+和Fe3+，測定不同金屬離子對菌株發酵酶活的影響，結果（表3）顯示，金屬離子對纖維素酶活的影響相對較小，但是K+對酶活有一定的促進作用。因此，在菌株發酵過程中可以添加少量的K+作為促進劑。

表3 不同金屬離子對纖維素酶活的影響

2.7 添加表面活性劑對纖維素酶活力的影響

絡合劑EDTA二鈉和陰離子表面活性劑SDS，對菌株JG產生FPA、CMCase、BGL三種酶活性均有明顯的抑制作用（圖4）。PEG、卵磷脂和鼠李糖脂都是非離子表面活性劑，它們對JG產生的纖維素酶活性卻有一定的促進作用，其中PEG促進作用較小，并且對CMCase、BGL酶活性的產生抑制作用，但能提高FPA酶活性；而鼠李糖脂和卵磷脂卻有明顯的促進作用。但是鼠李糖脂價格較高，將增加工業應用的生產成本，相比之下，卵磷脂價格低廉、材料易得且無污染，更易成為首選。本實驗中添加卵磷脂后，菌株JG所產的FPA、CMCase、BGL酶活性分別提高了72.9%、20.8%、33.6%，與添加鼠李糖脂的效果相同，故選擇卵磷脂作為JG發酵產酶的最適表面活性劑。

2.8 菌株JG產酶SDS-PAGE分析

將優化后菌株JG所產的纖維素酶組分進行了分析，結果（圖5）顯示，超濾后的3個目標蛋白大小約為55、37 和33 kD。發酵產物蛋白的譜型與商品酸性纖維素酶譜比較相近，具體成分有待進一步分離純化后分析。

圖4 不同種類表面活性劑對菌株產酶影響

圖5 纖維素酶SDS-PAGE分析

3 討論

本實驗從含有腐爛樹葉和秸稈的土壤中篩選到一株纖維素降解菌，形態學和分子生物學鑒定為草酸青霉菌，命名Penicillium oxalicum JG。近幾年，對于草酸青霉菌產纖維素酶能力的研究比較集中，青島農業大學張名愛等［18，19］證明了分離出的鵝源草酸青霉（Penicillium oxalicum Currie&Thom）F67，具有產纖維素酶、果膠酶及溶磷等特性，并已有廣泛的應用。楊友坤等［20］從牛糞堆肥樣品中篩選出一株草酸青霉菌，命名為Penicillium oxalicum F12，具有較強的纖維素降解能力，在高纖維類物質堆肥過程中有著較大的應用潛力。王洪媛等［21］從土壤中篩選到一株降解能力較強的草酸青霉菌，命名為Penicillium oxalicum 98MJ，其對半纖維素、纖維素及木質素都有較好的降解效果，是一株具有開發潛力的纖維素酶生產菌株。本研究通過對篩選獲得的草酸青霉菌JG進行產酶單因素優化，確定初始pH值為2.0-3.0，CMC-Na和豆粉為最優產酶條件。張蔚等［22］所篩選的草酸青霉菌在初始pH值7.0，以 4%麩皮和0.2%牛肉膏為最適產酶底物。本實驗還對不同金屬離子對產酶的影響進行了研究，結果表明，添加K+對菌株產酶具有一定的促進作用，但是效果并不明顯。

菌株JG的最適初始發酵pH為2.0左右，發酵過程中pH值維持在4.0左右。穆春雷等［23］曾經篩選出一株草酸青霉菌M11（Penicillium oxalicum M11），該菌株在初始pH為6.5，發酵過程中pH值為5.0時產酶達到最適。耿麗萍等［24］對草酸青霉菌HB1的產酶條件優化后指出其菌株最適初始pH為4.0-7.0之間，發酵pH為7.0時，酶活力最旺盛。由此可知，本研究獲得的草酸青霉菌JG為具備較強耐酸性的產纖維素酶菌株，其原因可能與草酸青霉菌代謝產酸有關。當工業上對纖維素類物質的處理采用酸時，該菌可以表現出較強的耐酸性，具有實際的應用價值。

表面活性劑由于結構的特殊性，具有改變酶作用微環境的功能。劉佳等［25］研究了吐溫-80和鼠李糖脂對綠色木霉產纖維素酶的影響，發現鼠李糖脂促進產酶效果明顯高于吐溫-80。卵磷脂作為兩性離子表面活性劑，在酸性環境中，呈陽離子表面活性劑的性質，可以使菌絲在培養基中分散更均勻，增加與底物接觸，從而對菌株產酶有很大促進作用。卵磷脂對纖維素酶的作用機理很早之前就有研究。繆煒等［26］經研究發現卵磷脂可作用于內切葡聚糖酶，引起酶構象的變化，并且與作用pH值和卵磷脂添加濃度有很大的關系。本研究選用的JG發酵培養基中分別添加鼠李糖脂和卵磷脂，培養7 d后，內切葡聚糖苷酶、β-糖苷酶和濾紙酶活性較其它幾種表面活性劑誘導產生的酶活性都達到最大值，結果非常相近。添加卵磷脂的最終濾紙酶活0.41 IU/mL、內切纖維素酶活0.978 IU/mL、β-葡萄糖苷酶活1.192 IU/mL，分別提高了72.9%、20.8%和33.6%。考慮到鼠李糖脂由于成本較高，不適于大規模的工業應用；相比之下，卵磷脂更具有工業應用的潛質。

4 結論

本研究從含有枯枝腐葉及牛糞的土壤樣品中篩選出一株具有纖維素降解能力的草酸青霉菌，命名為草酸青霉菌JG（Penicillium oxalicum JG）。該菌株在最適碳源、氮源底物和最適發酵初始pH條件下產酶能力有顯著提高。生物表面活性劑卵磷脂菌株JG產酶具有明顯的促進作用。

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（責任編輯 李楠）

The Optimization of Fermentation Condition for Cellulase Production by Penicillium oxalicum

LI Yang GAO Xiao-rong ZHANG Jian
（School of Life Science and Technology，Dalian University of Technology，Dalian 116024）

Cellulase plays an important role in the biological energy， textile， feed， paper industry， et al. Screening efficient strains and optimizing the fermentation condition are the effective way of obtaining cellulase. A cellulose-degrading strain JG was isolated from the soil containing rotten wood and straw. Morphology and molecular phylogenetic studies were used for its identification. Some factors during its fermentation were optimized， including initial pH， carbon source， nitrogen source and surfactants. The strain JG was identified as Penicillium oxalicum by analyzing its morphology and ITS（Internal Transcribesd Spacer）gene sequence phylogenetic systematics. Its optimal cultural conditions for the highest cellulase production were as following：initial pH values 2-3， carbon and nitrogen source were CMC-Na and soybean meal. Studying the effects of adding different kinds of surfactant on the fermentation process demonstrated that the lecithin of wide source and relatively low price had an obviously high effects on the cellulase production in JG， and the enzyme activities of FPA， CMCase， and BGL increased by 72.9%， 20.8% and 33.6% respectively. In conclusion， JG produced cellulase under lower initial pH， and lecithin enhanced its cellulase activity significantly.

Penicillium oxalicum；cellulase；lecithin；optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.020

2015-05-05

國家自然科學基金項目（31200084）

李洋，女，碩士研究生，研究方向：微生物；E-mail：443897205@qq.com

高曉蓉，女，副教授，研究方向：微生物；E-mail：biogaoxr@dlut.edu.cn