γ-谷氨酰轉肽酶補料法合成L-茶氨酸工藝研究

傅嘉懿陳晟吳敬

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，無錫 214122；2.江南大學生物工程學院 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122）

γ-谷氨酰轉肽酶補料法合成L-茶氨酸工藝研究

傅嘉懿1陳晟2吳敬1

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，無錫 214122；2.江南大學生物工程學院 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122）

對γ-谷氨酰轉肽酶酶法制備L-茶氨酸的工藝進行優(yōu)化。通過恒速補料的策略，以200 mmol/L L-谷氨酰胺和2 mol/L乙胺鹽酸鹽作為初始底物，37℃、pH10.0條件下反應，每2 h補加100 mmol L-谷氨酰胺，反應14 h，最終L-谷氨酰胺底物總濃度為900 mmol/L，L-茶氨酸的生成量達到573.2 mmol/L，轉化率達到63.7%，生產強度為40.9 mmol/（h·L）。采用變速流加的工藝，以同樣的初始條件進行反應，每2 h補加L-谷氨酰胺至初始濃度200 mmol/L，反應15 h，最終L-谷氨酰胺總濃度為600 mmol/L，L-茶氨酸的生成量達到445.8 mmol/L，轉化率為74.3%，生產強度為29.7 mmol/（h·L）。

γ-谷氨酰轉肽酶；L-茶氨酸；恒速補料；變速補料

L-茶氨酸（L-Theanine，L-The）由日本科學家于1949年首次從綠茶中分離得到［1］，是茶葉中特有的游離氨基酸，是天然茶葉中的重要風味物質，具有抑制苦味物質、改善產品風味的作用。同時L-The還有鎮(zhèn)靜放松［2，3］、降低血壓［4，5］、控制體重［6］、增強免疫應答［7，8］、預防腫瘤［9，10，11］等功效，因此在食品添加劑和保健品中被廣泛應用。L-The自然界含量極少，從茶葉中提取成本很高，因此化學合成法是目前研究的主要方向。但是化學合成法存在反應時間長、收率低等缺點，同時由于需要采用高壓惰性氣體保護，因而生產成本居高不下。近年來，微生物發(fā)酵法和酶轉化法已成為研究的熱點。

γ-谷氨酰轉肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2）是谷胱甘肽代謝途徑中的一個關鍵酶，2002年Suzuki等［12］研究報道，Escherichia coli K-12來源的GGT酶可以將L-谷氨酰胺（L-Gln）上的γ-谷氨酰基轉移到乙胺受體上，催化合成L-The。由于這一過程位點特異性和光學選擇性強，無需對反應物進行保護和脫保護，反應過程中也不消耗ATP，因此利用GGT酶轉肽活性制備系列γ-谷氨酰基類化合物的研究成為生物催化領域的熱點。

在實驗室前期工作中已對GGT酶制備茶氨酸進行了初步研究，在L-Gln濃度為200 mmol/L時，L-The的摩爾轉化率為78%，同時發(fā)現(xiàn)L-The的摩爾轉化率隨L-Gln濃度的升高而降低，在底物濃度為500 mmol/L和1 000 mmol/L時，轉化率分別為58%和45%，產物濃度分別為290.2 mmol/L和450 mmol/L［12］，目前對高底物濃度條件合成L-The的研究尚無報道。在工業(yè)化生產中，較高的底物濃度可大大降低L-The的生產成本，因此本研究采用不同的補料策略，以期提高L-The在高濃度底物下的產量，為L-The的酶法工業(yè)化制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為實驗室保存，L-Gln（上海生工生物工程股份有限公司），乙胺鹽酸鹽（上海生工生物工程股份有限公司），L-The標品（Sigma公司），其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液制備 菌種活化后按體積分數(shù)2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、200 r/min 培養(yǎng)48 h，裝液量為250 mL發(fā)酵瓶裝50 mL。培養(yǎng)結束后將培養(yǎng)液以8 000 r/min離心20 min，收集上清液。

1.2.2 GGT酶活測定方法 以γ-谷氨酰對硝基苯胺和雙甘二肽為底物進行顏色反應［13］。酶活測定體系為1 mL，含終濃度為5 mmol/L γ-谷氨酰對硝基苯胺，80 mmol/L 雙甘二肽，50 mmol/L 硼砂-NaOH緩沖液，pH10.0，在37℃下加入20 μL適當稀釋的酶液反應5 min后，加入4 mol/L醋酸溶液400 μL終止反應，在分光光度計410 nm處測定吸光值。該條件下每分鐘生成1 μmol對硝基苯胺所需的酶量定義為一個酶活單位（U）。

1.2.3 酶法合成L-The 取一定濃度的L-Gln和乙胺鹽酸鹽用硼砂-NaOH緩沖液溶于500 mL燒杯中，加入一定量酶液，調節(jié)pH為10.0，體系終體積為300 mL，放置于37℃恒溫水浴鍋，以150 r/min的攪拌轉速進行酶反應，定時取樣進行分析。

1.2.4 L-The的檢測 以高效液相色譜（HPLC）檢測分析產物濃度［14］。

1.2.4.1 樣品處理 反應液取樣后用10%（W/V）的三氯乙酸等體積稀釋，室溫放置1-2 h，12 000 r/min離心10 min，再用0.22 μm水相針式濾器過濾，此時樣品可于HPLC檢測。

1.2.4.2 流動相配置 A相（1 L）：無水醋酸鈉4.52 g，加入1 L去離子水，攪拌溶解，再加入225 μL三乙胺，醋酸調節(jié)pH到7.2±0.05，后加入5 mL四氫呋喃，混合后備用。

B相（1 L）：無水醋酸鈉4.52 g，去離子水定容為200 mL，醋酸調節(jié)pH到7.2±0.05，再加400 mL甲醇（色譜純）和400 mL乙腈（色譜純）。

A，B 相配置完畢后需用無油真空泵過膜抽濾，其中A 相使用0.22 μm 的纖維素膜，B 相使用0.45 μm尼龍膜，并將抽濾后的流動性與超聲清洗器中超聲15-30 min 排除氣泡。

1.2.4.3 衍生化試劑及程序 柱前衍生化反應采用鄰苯二甲醛（OPA）與2-巰基乙醇聯(lián)用，緩沖液為0.4 mol/L的硼酸緩沖液（pH10.2），具體試劑配方和柱前衍生化程序由Agilent公司提供。

1.2.4.4 HPLC色譜條件 檢測系統(tǒng)：Agilent 120；色譜柱：Eclipse XDB-C18 5 μm（4.6 mm×150 mm）；流動相：乙腈一水（75∶25）；流速：0.8 mL/min；柱溫：40℃；紫外檢測波長：338 nm。

梯度洗脫程序：流動相完全由A、B 兩相組成，初始比例為A∶B = 92∶8（V/V），一個樣品分離時間為20 min，流動相混合比例呈勻速線性變化，具體條件為：0-12 min，B 相為8%-26%（V/V）；12-14 min，B 相為26%-100%（V/V）；14-15.5 min，B相保持100%（V/V）；15.5-18.5 min，B 相為8%-100%（V/V）；18.5-20 min，B 相保持8%（V/V）。

1.2.5 L-The產率的計算 L-The摩爾轉化率公式：

2 結果

2.1 酶轉化生產L-The補料初始條件的確定

前期研究表明，采用酶轉化法生產L-The時，底物濃度過高會導致L-The轉化率下降，其原因主要是因為高濃度的底物L-Gln對GGT酶具有抑制作用，因此考慮使用較低的初始底物濃度，反應過程中補加L-Gln的補料策略以實現(xiàn)L-The的高濃度底物高轉化率生產。為確定補料過程的初始條件，首先研究了不同底物濃度和不同加酶量對L-The合成的影響。根據(jù)前期工作的結果，GGT酶催化合成L-The在底物濃度較低的條件下反應速度較快，且轉化率較高［13］，因此選擇研究L-Gln濃度為200 mmol/L和100 mmol/L 條件下，研究不同加酶量對反應的影響。

首先以200 mmol/L L-Gln和2 mmol/L乙胺鹽酸鹽為底物，研究加酶量為2、6和10 U/mL時，對L-The合成的影響。結果（圖1）顯示，在加酶量為2 U/mL時，酶轉化在前3 h反應較快，后2 h反應逐漸趨于平衡；而在加酶量為6 U/mL 和10 U/mL時，酶轉化在前2 h反應較快，后3 h反應逐漸平衡。在反應進行至2 h時，L-The對底物L-Gln的摩爾轉化率分別為29.5%、54.4%和58.9%，反應5 h轉化率分別為62.4%、69.3%和77.1%。以100 mmol/L L-Gln和1 mol/L乙胺鹽酸鹽為底物，研究加酶量為2、4和6 U/mL時對L-The合成的影響。結果（圖2）顯示，當加酶量分別為2、4和6 U/mL，反應進行至2 h時，L-The對L-Gln的摩爾轉化率分別為44.2%、60.2%和80.9%，最終轉化率分別為80.4%、92.5%和93.6%。

圖1 L-Gln初始濃度為200 mmol/L的過程曲線

圖2 L-Gln初始濃度為100 mmol/L的過程曲線

綜上所述，在不同底物濃度的條件下，加酶量為2 U/mL時，酶反應在前3 h速率較快，加酶量為6 U/mL和10 U/mL時，酶反應都在前2 h速率較快，2 h后反應速率降低，因此初步確定以2 h作為后續(xù)補料過程的補料間隔。圖1和圖2顯示，底物L-Gln濃度為200 mmol/L，加酶量6 U/mL與10 U/mL相差7.8%，但是比2 U/mL有明顯提高，所以加酶量6 U/mL是最優(yōu)條件，此條件下反應2 h產物濃度達到120 mmol/L左右。而在L-Gln濃度為100 mmol/L時，反應2 h產物濃度最高僅能達到80 mmol/L，由于工業(yè)生產追求的是高產量，也就是較高的產物濃度，所以選擇底物濃度200 mmol/L，加酶量6 U/mL作為后續(xù)補料過程的初始條件。

2.2 酶轉化生產L-The恒速補料策略研究

以200 mmol/L L-Gln和2 mol/L乙胺鹽酸鹽為初始底物，加酶量為6 U/mL，在pH 10.0和37℃條件下，研究不同的補料量對L-The合成的影響。由于將底物維持在較低濃度能保持較高的反應速率，所以選擇每2 h進行恒速補料，L-Gln補料量分別為200、150和100 mmol。

首先以每2 h添加200 mmol L-Gln固體粉末的補料方式，研究對L-The合成的影響。由于合成L-The的反應要求L-Gln與乙胺鹽酸鹽的摩爾比在1∶5-1∶10范圍內，因此在反應過程中每4 h補加400 mmol乙胺固體以保證乙胺鹽酸鹽的濃度。結果（圖3）顯示，底物L-Gln在反應前4 h消耗較大，每2 h濃度下降120 mmol/L左右，隨著反應進行，L-Gln消耗速率逐漸降低，反應至4-6 h時，L-Gln消耗速率為89.5 mmol/L，6-8 h為80.4 mmol/L，分析原因是由于隨著酶轉化反應進行，反應液L-Gln和L-The濃度都逐漸上升，正逆反應速度逐漸達到平衡，致使反應速率進一步下降。8-11 h和11-14 h底物濃度下降僅為37.6 mmol/L和22.5 mmo/L。反應至14 h最終L-Gln的總濃度為1 000 mmol/L，L-The的濃度達到562 mmol/L，轉化率為56.2%。

圖3 每2 h補料200 mmol的恒速補料過程曲線

以每2 h添加150 mmol L-Gln固體粉末，每4 h補加400 mmol乙胺鹽酸鹽固體的補料方式，研究對L-The生產的影響。結果（圖4）顯示，L-Gln在反應前6 h消耗較快，每2 h消耗量為120 mmol/L左右，6 h后L-Gln消耗速率降低，6-8 h底物消耗量為97.6 mmol/L，8-10 h底物消耗量為56.4 mmol/L，10 h后反應速率大幅下降，反應在14 h左右時達到平衡。最終L-Gln的總濃度為950 mmol/L，L-The的濃度達到573 mmol/L，轉化率為63.7%。

圖4 每2 h補料150 mmol的恒速補料過程曲線

研究以每2 h添加100 mmol L-Gln固體粉末，每4 h補加400 mmol乙胺鹽酸鹽固體的補料方式對酶轉化的影響。結果（圖5）顯示，L-Gln在反應前8 h消耗很快，每2 h消耗量為120 mmol/L左右，8 h后L-Gln消耗略有降低，8-10 h L-Gln消耗量為80.3 mmol/L，10-12 h為54.8 mmol/L，12 h后反應速率下降，L-Gln幾乎不消耗。而L-The在前12 h的合成速率都較大，12 h后速率下降，約在16 h達到平衡。最終L-Gln的總濃度為900 mmol/L，L-The的濃度達到610.1 mmol/L，轉化率為67.8%。

2.3 酶轉化生產L-The變速補料策略研究

根據(jù)上述的結果，在恒速補料的情況下，反應初期底物濃度較低，所以反應速率較快，而反應后期由于底物的累積導致反應變慢，逐漸達到平衡。因此嘗試采用變速補料的工藝，以200 mmol/L L-Gln和2 mol/L乙胺鹽酸鹽為初始底物，加酶量為6 U/mL，在pH10.0和37℃條件下，每2 h測定L-Gln的含量，從而確定補加L-Gln的量，保證補料后L-Gln濃度為200 mmol/L，同時每4 h添加400 mmol乙胺鹽酸鹽固體，研究變速補料對L-The合成的影響。結果（圖6）顯示，每2 h所需補加的L-Gln量在反應前期較多，隨著反應進行，反應速率降低，補加的底物逐漸減少，反應進行到18 h后，反應液中底物濃度幾乎不變，可以認為反應已經達到平衡，所以不再進行補料。最終L-Gln總濃度為600 mmol/L，L-The濃度最終達到445.8 mmol/L，轉化率為74.3%。

圖5 每2 h補料100 mmol的恒速補料過程曲線

圖6 變速補料過程L-Gln和L-The濃度曲線

2.4 不同補料工藝的研究

通過對恒速補料和變速補料工藝的比較發(fā)現(xiàn)，不同的轉化工藝所需的反應周期不同，產生的L-The的濃度也不同。表1顯示，從轉化率角度，變速補料工藝的轉化率最高，達74.3%，但所達到的底物濃度僅為600 mmol/L，導致生產強度較低，為29.7 mmol/（h·L），遠低于恒速補料的生產強度。而比較不同的恒速補料策略，生產強度差異較小，轉化率和產物終濃度都以100 mmol/2 h恒速補料工藝最高，達67.8%和610.1 mmol/L，基本滿足了L-The在高底物濃度條件下能達到高轉化率和高產物濃度的要求。因此，以100 mmol/2 h恒速補料進行茶氨酸的生產最能適應工業(yè)化生產要求。

3 討論

L-The作為一種具有重要價值的非蛋白氨基酸，已經成為研究茶葉中功能活性成分的熱點。目前L-The的合成主要以化學合成法為主，但是化學合成得到的產物存在一定的安全性問題，同時容易產生DL-型消旋體，因此近年來以酶法合成L-The逐漸被廣泛研究。

2002年，來自日本的Suzuki等［15］利用GGT酶，以200 mmol/L的L-Gln和1.5 mol/L的乙胺為底物合成L-The，轉化率可達到60%，產物濃度為120 mmol/L。Shuai等［16］以20 mmol/L的L-Gln和0.05 mol/L的乙胺為底物，L-The的轉化率達到94%，產物濃度為18.8 mmol/L。孫帥［17］以200 mmol/L的L-Gln和1.8 mol/L乙胺合成L-The，反應36 h轉化率達到86%，產物濃度達到172 mmol/L。李勤等［18］將來源于E. coli DH5α的GGT酶基因克隆到高表達質粒pET-32α中，并轉化E. coli BL21，構建茶氨酸生物合成的工程菌，直接以工程菌為催化劑，以L-Gln和乙胺鹽酸鹽為底物，在一定條件下反應6 h，L-The轉化率為41.05%。

利用其它酶轉化L-The的研究也有報道。1998年，Tachiki等［19］利用谷氨酰胺酶，以500 mmol/L的L-Gln和1.5 mol/L的乙胺為底物，L-The的轉化率為47%，產物濃度為235 mmol/L。2005年，Yamamoto等［20］報道了以200 mmol/L的L-谷氨酸鈉和1.2 mol/L的乙胺為底物，L-The的轉化率達到85%，濃度為170 mmol/L的產物。2008年，Tachiki等［21］以300 mmol/L的L-Gln和0.9 mol/L的乙胺為底物，獲得L-The的轉化率為55%，濃度為165mmol/L的產物。Yokoyama和Itoh［22，23］分別報道了一種在介孔硅材料上固定化谷氨酰胺酶，再由其催化合成L-The的方法。2008年，Yamamoto等［24］利用γ-谷氨酰甲胺合成酶，以600 mmol/L的L-谷氨酸鈉和0.6 mol/L的乙胺為底物，L-The的轉化率可達到100%，產物濃度達到600 mmol/L。

表1 不同補料工藝的比較

傳統(tǒng)的酶轉化過程中，在底物濃度較低的情況下，L-Gln消耗速率較快，L-The合成速度快；而在高底物濃度下，L-Gln消耗減慢，產物合成速率較慢。因此本實驗研究了不同的補料方法，并通過比較得出以200 mmol/L的L-Gln和2 mol/L的乙胺鹽酸鹽為初始底物，加酶量6 U/mL，每2 h補加100 mmol L-Gln，反應16 h為最優(yōu)工藝。在最優(yōu)條件下L-The的轉化率可以達到67.8%，產物濃度達到610.1 mmol/L，生產強度為38.1 mmol/（h·L）。

4 結論

通過采用恒速補料和變速補料的策略，在L-Gln濃度為900 mmol/L和600 mmol/L時，轉化率分別達到67.8%和74.3%，生產強度分別為38.1 mmol/（h·L）和29.7 mmol/（h·L）。本研究通過補料工藝進行L-The的合成，即使在高底物濃度下，仍能獲得令人滿意的底物轉化率，且步驟簡單，成本低廉，具有較好的應用前景。

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（責任編輯 馬鑫）

A Research of L-theanine Synthesis with Two Feeding Methods of L-glutamine Using γ-glutamyltranspeptidase

FU Jia-yi1CHEN Sheng2WU Jing1
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

The optimization of L-theanine production by γ-GGT（gamma-glutamyltranspeptidase）was investigated. The constant speed feeding strategy was performed using 200 mmol/L L-glutamine and 2 mol/L ethylamine hydrochloride as the initial substrates，under the condition of 37℃，pH10.0，100 mmol/L L-glutamine was added every 2 hours and the reaction sustained for 14 hours. Eventually the total concentration of L-glutamine and L-theanine were 900 mmol/L and 573.2 mmol/L respectively. The conversion rate of L-theanine reached 63.7%，and the production intensity was 40.9 mmol/（h·L）. The variable speed feeding process conducted for 15 hours with the same initial conditions，and the adding L-glutamine to the initial concentration of 200 mmol/L in every 2 hours. After 15 hours，600 mmol/L of L-glutamine was converted to L-theanine with a final concentration of 445.8 mmol/L and the conversion rate and production intensity reached 74.3% and 29.7 mmol/（h·L）.

γ-glutamyltranspeptidase；L-theanine；constant speed feeding；constant speed feeding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.022

2015-03-12

傅嘉懿，女，碩士研究生，研究方向：工業(yè)酶技術；E-mail：rorjil@hotmail.com

吳敬，女，博士，教授，研究方向：基因工程和分子酶學工程；E-mail：jingwu@jiangnan.edu.cn