香魚精氨酸酶II基因的cDNA克隆及其表達與鰻弧菌感染的相關性

丁斐斐 李長紅 陳炯 張琪

（寧波大學海洋學院 生物化學與分子生物學實驗室，寧波 315211）

香魚精氨酸酶II基因的cDNA克隆及其表達與鰻弧菌感染的相關性

丁斐斐 李長紅 陳炯 張琪

（寧波大學海洋學院 生物化學與分子生物學實驗室，寧波 315211）

精氨酸酶II（arginase II，Arg-II）是精氨酸酶的一種，不僅可以參與機體尿素循環，還與機體病理過程密切相關。通過香魚（Plecoglossus altivelis）單核/巨噬細胞轉錄組測序獲得香魚Arg-II基因全長cDNA序列，結果表明，Arg-II基因由4 707個核苷酸組成，包含一個大的開放閱讀框，編碼348個氨基酸，預測分子量為38.09 kD，等電點為6.15。氨基酸序列多重比對結果顯示，香魚Arg-Ⅱ具有典型的Arg-Ⅱ結構特征，與虹鱒（Oncorhynchus mykiss）Arg-Ⅱ同源性最高，為85.3%；系統進化樹分析表明，魚類Arg-Ⅱ形成一個大簇，香魚Arg-Ⅱ與虹鱒Arg-Ⅱ進行相關性最高。實時熒光定量PCR（quantitive real-time PCR，qRTPCR）結果顯示，香魚Arg-Ⅱ基因mRNA主要在健康香魚肝、腦、頭腎和單核/巨噬細胞中表達；鰻弧菌（Vibrio anguillarum）感染后，香魚肝、腦、頭腎和單核/巨噬細胞Arg-Ⅱ基因mRNA的表達量顯著上調。綜上，香魚Arg-Ⅱ基因的表達與鰻弧菌感染緊密相關，揭示其可能在魚類抗感染免疫應答中發揮重要作用。

香魚；精氨酸酶II；鰻弧菌；單核/巨噬細胞；表達

精氨酸酶（arginase）是在細菌、酵母、植物、無脊椎動物和脊椎動物中普遍存在的酶。在植物和排氨動物中精氨酸酶位于線粒體，而在排尿素動物中，精氨酸酶位于細胞質。細胞質和線粒體中的精氨酸酶是同功酶，由不同的基因精氨酸酶I（arginase I，Arg-I）和精氨酸酶II（arginase II，Arg-II）編碼［1］。Arg-I和Arg-II的基本功能是在機體尿素循環中將L-精氨酸水解成L-鳥氨酸和尿素，但二者在免疫系統中也有表達，并且在哺乳動物免疫系統中起著關鍵作用，參與炎癥反應的各個階段［2］。在巨噬細胞中，Arg-I和誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）參與L-精氨酸/NO代謝，分別與M1和M2型巨噬細胞表型有關，被廣泛用作鑒定M1和M2型巨噬細胞的分子標記［3］。與Arg-I相比，Arg-II在巨噬細胞炎癥應答中的功能相關的研究報道很少，普遍認為它具有與Arg-II相同的功能。然而，越來越多的證據表明，Arg-I和Arg-II在巨噬細胞功能調節中具有不同的作用。例如，在小鼠中，LPS可誘導巨噬細胞Arg-II mRNA的表達，但不能誘導Arg-I mRNA的表達［1］。

目前，Arg-I和Arg-II基因在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［4，5］和鯉魚（Cyprinus carpio）［6］等少數硬骨魚類中被克隆和鑒定。在虹鱒中，虹鱒幼魚絕食6周后，肝組織精氨酸酶活性明顯增加，并且Arg-II基因mRNA的表達量也明顯增加，但Arg-I基因mRNA的表達量無明顯變化，因此，肝組織Arg-II基因mRNA的表達量增加可能導致精氨酸酶活性增加［4］；而且兩個虹鱒品系感染腦粘體蟲（Myxobolus cerebralis）后，T和H品系分別在感染后2 h 和8 d時Arg-II基因mRNA的表達量均顯著上調［5］；在鯉魚中，環腺苷酸（cyclic adenosine mono phosphate，cAMP）刺激后頭腎來源巨噬細胞中的精氨酸酶活性顯著增加，而且cAMP刺激能誘導Arg-II基因mRNA的表達，但Arg-I基因mRNA的表達也不受影響［6］，揭示魚類Arg-II可能具有與哺乳動物Arg-II相似的功能。

香魚（Plecoglossus altivelis）是東亞地區中國、日本和朝鮮等國特有的一種小型名貴經濟魚類。它體色美、味清香、肉質細膩，在國際上被譽為“淡水魚之王”，深受消費者青睞。近年來，由于捕撈強度增大、水利設施建設以及環境污染日益嚴重等原因，野生香魚已瀕臨滅絕。為了滿足國內外市場尤其是國際市場對香魚的需求，香魚人工養殖在中國大陸也迅速興起。目前，香魚的人工養殖在沿海各省均有開展，主要集中于浙江、福建、江蘇、山東、遼寧等地，養殖的香魚大部分出口日本和歐美等發達國家，效益十分可觀。然而，隨著養殖規模的不斷擴大，由傳染性疾病引起的養殖香魚大量死亡事件時有發生，給中國沿海地區的香魚養殖業造成巨大損失［7］。因此，有必要從魚類自身免疫調控入手，對其抗細菌感染的分子機制進行深入研究。本研究通過香魚單核/巨噬細胞轉錄組測序，獲得香魚Arg-II基因的cDNA序列，對序列進行比對及進化關系分析，并明確其mRNA的組織表達特征，隨后檢測鰻弧菌感染后香魚重要組織及單核/巨噬細胞中Arg-II基因mRNA的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料

健康香魚（20-25 g）購自寧波水產大世界，規格均一、無病無傷。充氣運回實驗室暫養，暫養水溫（20±1）℃，期間不間斷充氣，早晚各換水一次，不投喂餌料。

鰻弧菌分離株ayu-H080701分離自患弧菌病香魚［7］，由本實驗室保存。RNAiso試劑、AMV逆轉錄酶、dNTPs、SYBR Premix Ex Taq 試劑盒和Ex Taq DNA 聚合酶均購自 TaKaRa 公司（日本）。Ficoll購自Invitrogen公司（上海），RPMI1640培養基、胎牛血清（FCS）購自Gibco公司（美國）。引物合成及序列測定由英維捷基貿易有限公司合成（上海）。

1.2 方法

1.2.1 香魚Arg-II基因cDNA序列的獲得及序列分析 采用Illumina HiSeq 2000測序平臺對香魚頭腎來源的單核/巨噬細胞進行轉錄組測序，從測序結果中篩選Arg-II相關Unigenes，通過特異性引物PCR擴增cDNA和測序驗證序列準確性。同源蛋白序列比對采用BLASTP 軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/）；信號肽序列預測采用SignalP 4.1軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；蛋白分子量大小及等電點測定采用Compute pI/Mw程序（http：//web.expasy.org/compute_pi/），多重序列比對采用ClustalW軟件（http：//clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）；系統進化樹構建采用MEGA 5.0軟件［8］；線粒體靶向肽預測采用MitoProt軟件（http：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot. html）。氨基酸序列多重比對及進化樹構建所用序列信息詳見表1。

表1 氨基酸序列多重比對及進化樹構建所用序列

1.2.2 樣品采集

1.2.2.1 組織樣品采集 香魚暫養1周后，隨機選取5尾，分別取肝、脾、腎、頭腎、腦、心、鰓、肌肉和腸組織立即投入液氮保存，隨后轉于-70℃超低溫冰箱保存，收集的組織作為健康香魚樣品。其余香魚分為對照組和注射組用于鰻弧菌感染實驗，鰻弧菌感染香魚的實驗過程及感染劑量參考楊旦陽等［9］的方法，具體步驟如下。注射組香魚以1.0×104CFU/尾的濃度腹腔注射鰻弧菌菌懸液，對照組香魚注射等體積的無菌生理鹽水，于感染后4、8、12和24 h取肝、脾、腎、頭腎、腦和腸等組織，立即投入液氮中，隨后轉于-70℃超低溫冰箱保存。

1.2.2.2 香魚頭腎來源的單核/巨噬細胞分離培養 將香魚麻醉，用無菌注射器從尾靜脈取血，然后快速取出頭腎，用無菌剪刀將頭腎剪碎置尼龍網內，加入適量含2% FCS的RPMI1640培養基，用10 mL注射器活塞頭輕柔研磨頭腎組織，使頭腎細胞通過尼龍網進入離心管中；采用Ficoll密度梯度離心法離心，棄上清，用含2% FCS的RPMI1640培養基洗滌細胞，最后將細胞重懸于含2% FCS的RPMI1640培養基中。將細胞懸液鋪于直徑為35 mm的細胞培養皿中，24℃過夜培養，PBS洗去非黏附細胞，然后向培養基中加入10% FCS的RPMI1640培養基。用姬姆薩染色后顯微鏡下觀察，確定95%的黏附細胞是單核/巨噬細胞。

1.2.2.3 鰻弧菌感染香魚單核/巨噬細胞 用PBS將鰻弧菌稀釋至合適濃度，按照感染復數（multiplicity of infection，MOI）為20∶1的比例接種至香魚單核/巨噬細胞中，對照組加入等體積的PBS，于感染后4、8、12和24 h時小心吸走培養基，PBS洗滌3次后加入1 mL RNAiso試劑，室溫孵育5 min以裂解細胞，收集裂解液作為香魚單核/巨噬細胞樣品，保存于-70℃超低溫冰箱備用。

1.2.2.4 香魚Arg-II基因 mRNA的組織表達特征采用qRT-PCR測定健康香魚不同組織中Arg-II基因 mRNA的表達特征。參考黃左安等［10］的方法進行總RNA抽提、第一鏈cDNA合成和qRT-PCR分析。根據香魚ArgⅡ基因全長cDNA序列設計qRTPCR的檢測引物，預期擴增片段為158 bp（表2）。以香魚β-actin基因作為內參，預期的擴增片段長度為231 bp。以香魚各組織第一鏈cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，25 μL的擴增體系包括：ddH2O 10 μL、SYBR Premix Ex Taq（2×）緩沖液12.5 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA模板0.5 μL。擴增反應在北京博奧生物芯片有限公司生產的晶芯RT-Cycler實時熒光定量PCR 儀上進行，反應條件為：94℃ 180 s（預變性，1個循環）；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s（擴增段，共40個循環）；94℃ 30 s，72℃ 60 s，95℃ 30 s（熔解段，1個循環）。qRT-PCR檢測時每個樣品重復3次，包括目的基因（Arg-II）和內參基因（β-actin）。利用相對標準曲線法2-ΔΔCt對定量結果進行計算，分析Arg-II基因mRNA的相對表達量［11］。

1.2.3 感染鰻弧菌對香魚重要組織和單核/巨噬細胞Arg-II基因mRNA表達的影響 以鰻弧菌感染香魚的肝、脾、腎、頭腎、腦和腸等組織以及鰻弧菌體外感染的香魚單核/巨噬細胞cDNA為模板，采用qRT-PCR技術檢測Arg-II基因mRNA的表達變化。總RNA抽提、第一鏈cDNA合成和qRT-PCR分析見1.2.3。

表2 qRT-PCR所用引物

2 結果

2.1 香魚Arg-II基因cDNA序列分析

轉錄組測序和特異引物PCR擴增測序揭示，香魚Arg-II基因cDNA序列長4 707個核苷酸（Gen-Bank登錄號：KR018612），包含一個1 047 bp的大開放閱讀框架，推測編碼一個由348個氨基酸組成、相對分子質量為38.09 kD的蛋白，等電點為6.15，N-末端無信號肽序列。氨基酸序列多重比對結果（圖1）顯示，香魚Arg-II具有典型的Arg-II結構特征，N-末端含由41個氨基酸組成的線粒體靶向肽，分子內含4段精氨酸家族的特征性序列。

序列分析表明，香魚Arg-II與其它魚類Arg-II氨基酸序列同一性為81.6%-85.3%，其中與虹鱒Arg-II氨基酸序列同一性最高，達85.3%；與哺乳動物、鳥類及兩棲動物Arg-II的氨基酸序列同一性僅為51.2%-63.3%。系統進化樹（圖2）分析揭示，哺乳動物、鳥類、兩棲類和魚類的Arg-II分別成簇，香魚Arg-II位于魚類Arg-II這一個大簇，且與虹鱒Arg-II進化關系最近。

2.2 健康香魚Arg-II基因mRNA的組織表達特征

取健康香魚心、肝、脾、體腎、頭腎、鰓、腦、腸和肌肉等進行qRT-PCR檢測，香魚Arg-II基因擴增產物為158 bp，內參β-actin基因擴增產物為231 bp。結果（圖3）表明，健康香魚Arg-II基因mRNA主要在肝、腦和單核/巨噬細胞中表達，其次是頭腎、腸、體腎和脾，其他組織中微弱表達。

2.3 香魚Arg-II基因mRNA的表達與鰻弧菌感染的相關性

根據Arg-II基因在健康香魚組織中的表達特征，選取鰻弧菌感染的香魚肝、腦和頭腎組織，以及鰻弧菌感染的體外培養的頭腎來源單核/巨噬細胞，進行qRT-PCR分析。結果（圖4）表明，香魚肝組織中Arg-II基因mRNA表達量在感染4 h時開始增加，8 h時顯著高于對照組，為對照組的5.2倍，12 h時略有降低，24 h時回復至對照組水平；頭腎組織中Arg-II基因mRNA表達量在感染8 h和12 h時顯著高于對照組，分別為對照組的1.97倍和2.38倍；腦組織中Arg-II基因mRNA的表達量在感染4 h時開始增加，12 h時顯著高于對照組，為對照組的1.79倍，隨后降低，24 h時與對照組無明顯差異；香魚頭腎來源單核/巨噬細胞在鰻弧菌感染后，Arg-II基因mRNA的表達量逐漸增加，12 h時表達量最高，為對照組的3.1倍，24 h略有降低，但仍顯著高于對照組，為對照組的2.6倍。

3 討論

本研究通過香魚單核/巨噬細胞轉錄組測序獲得了Arg-II基因的全長cDNA序列。序列分析表明，預測的香魚Arg-II蛋白氨基酸序列與其他物種Arg-II的結構相似，N-末端包含一個線粒體靶向肽。Arg-II是線粒體蛋白，需要通過N-末端線粒體靶向肽進入線粒體基質。MitoProt軟件分析表明，硬骨魚類、兩棲類與哺乳動物Arg-II N-末端線粒體靶向肽的長度和序列上差異明顯，但有兩個共同特征，精氨酸、丙氨酸和絲氨酸等陽離子氨基酸殘基含量豐富，天冬氨酸和谷氨酸等陰離子氨基酸殘基含量稀少［4］。系統進化樹分析表明，魚類Arg-II獨立成簇，香魚與虹鱒Arg-II進化相關性最高。組織差異特征分析表明，Arg-II基因在健康香魚各組織中分布廣泛，其中肝、腦和單核/巨噬細胞表達量最高，這與虹鱒、鯉魚中的研究結果較為一致［4，6］。

圖1 香魚與其他物種Arg-II全長氨基酸序列多重比對結果

圖2 基于Neighbor-Joining法構建香魚和其他物種全長Arg-II氨基酸序列的系統進化樹

圖3 健康香魚Arg-II基因mRNA的組織表達特征

在哺乳動物中，Arg-II不僅參與機體尿素循環，還與機體病理過程密切相關。早期的研究表明，Arg-II基因是抑制巨噬細胞炎癥因子表達的肝X（liver X receptor）受體的直接靶標，因此，它最初被認為具有抗炎功能［12，13］。與哺乳動物相比，硬骨魚類Arg-II的研究報道相對較少，已有的研究揭示，Arg-II可能與魚類免疫反應密切相關。例如，在虹鱒中，虹腦粘體蟲感染后，品系T和H在感染后2 h和8 d時Arg-II基因mRNA表達量均顯著增加，分別增加了4倍和2.7倍［5］；在鯉魚中，cAMP處理后，頭腎來源巨噬細胞精氨酸酶活性顯著增加，Arg-II基因表達量在6 h達到最大，約為對照組的16倍［6］。本研究中，鰻弧菌腹腔注射香魚后，Arg-II mRNA表達在頭腎和單核/巨噬細胞中顯著上調，這與上述研究結果較為一致。同時，香魚肝和腦中Arg-II基因表達量也在鰻弧菌感染后顯著上調，揭示Arg-II與魚類病原感染引起的免疫應答密切相關，可能通過激活巨噬細胞旁路激活途徑參與免疫反應，但具體作用機制有待于進一步研究。

4 結論

香魚Arg-II基因cDNA序列與虹鱒Arg-II序列最相似。健康香魚中，Arg-II mRNA主要在肝、腦和單核/巨噬細胞中表達；鰻弧菌感染后，Arg-II mRNA表達量顯著上調，揭示Arg-II與香魚抗病原感染的免疫反應緊密相關。

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圖4 鰻弧菌感染對香魚重要組織及單核/巨噬細胞Arg-II基因mRNA表達的影響

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（責任編輯 李楠）

cDNA Cloning of Arginase II Gene in Ayu（Plecoglossus altivelis）and the Correlation Between Its Expression and Vibrio anguillarum Infection

DING Fei-fei LI Chang-hong CHEN Jiong ZHANG Qi
（Biochemistry and Molecular Biology Laboratory，School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211）

Arginase II（Arg-II）is one kind of arginases. Not only can it participates in the urea cycle， but also has close correlation with pathological process. Here， we determined the whole cDNA sequence of Arg-II gene of ayu（Plecoglossus altivelis）by de-novo transcriptome sequencing of ayu monocytes/macrophages. The results showed that the cDNA sequence of the Arg-II was 4707 nucleotides， containing a large open reading frame that encoded a protein of 348 amino acids with a deduced molecular mass of 38.09 kD and a theoretical isoelectric point（pI）of 6.15. Multiple sequence alignment of complete amino acid sequences showed that ayu Arg-II had the typical characters of Arg-II in animals. Sequence comparison showed that ayu Arg-II shared the highest amino acid sequence identity（85.3%）with that of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）. Phylogenetic tree analysis also confirmed that fish Arg-II formed a cluster， and ayu Arg-II was most closely related to that of rainbow trout. Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）analysis showed that the mRNA of ayu Arg-II mainly had the expression in liver， brain， head kidney and monocytes/macrophages. Upon Vibrio anguillarum infection， the mRNA expression of gene Arg-II significantly up-regulated in the liver， brain， head kidney and monocytes/macrophages. In summary， our present study revealed a tight relationship between the ayu Arg-II expression and V. anguillarum infection， suggesting that ayu Arg-II plays an important role in fish immune response against bacterial infection. This study provides a theoretical basis for studying the functions of fish Arg-II， and its molecular mechanism in regulating fish immune response to pathogens.

Plecoglossus altivelis；arginase II；Vibrio anguillarum；monocytes/macrophage；expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.014

2015-03-28

國家自然科學基金項目（31402333），浙江省自然科學基金項目（LQ13C190002），高等學校博士學科點專項科研基金項目（20133305120008）

丁斐斐，女，研究方向：魚類分子免疫學；E-mail：dingfeifei14@163.com

李長紅，女，研究方向：魚類分子免疫學；E-mail：lichanghong0716@163.com