星點效應面法優化龍膽苦苷脂質體的制備工藝研究

宋艷麗

摘 要：目的：優化龍膽苦苷脂質體的處方。方法：以包封率為考察指標，采用逆向蒸發法，在單因素的實驗基礎之上采用星點效應面法對龍膽苦苷制備工藝進行優化。結果 確定龍膽苦苷脂質體處方為大豆卵磷脂與膽固醇用量比2.2：1，大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比19：1，磷酸緩沖液pH值為5.8。結論 在最優處方工藝條件下制備的龍膽苦苷脂質體包封率為63.78%，脂質體外觀成規則的圓球形，平均粒徑為178 nm，且粒徑分布均勻。

關鍵詞：龍膽苦苷；脂質體；包封率；星點效應面

中圖分類號：R286.1 文獻標識碼：A 文章編號：1006-8937（2016）24-0179-02

龍膽苦苷是從龍膽、秦艽等龍膽科植物中提取的環烯醚萜苷類化合物，藥理實驗表明龍膽苦苷具有明顯的保肝利膽[1]。一個比較罕見的天然具有鎮痛抗炎作用的化合物。但龍膽苦苷在生物體內吸收快、消除快，在大鼠體內代謝的消除半衰期只有0.64 h[2]。脂質體具有類細胞結構，能夠改變被包封藥物的體內分布，使藥物主要在肝、脾、肺和骨髓等組織器官中蓄積，從而提高藥物的治療指數、減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒性[3]，本文擬制備龍膽苦苷脂質體，目的在于提高藥物療效和生物利用度。

1 儀器和試藥

1.1 儀 器

LC-20AT型高效液相色譜儀（含LC-20AT型泵、SPD-20A型紫外可見雙波長檢測器，日本島津公司）；JEM-2000EX透射電子顯微鏡（日本電子公司）；HSE-D型循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；

RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；FY-200高壓勻質機（上海儀器廠）；TGL-168GB離心機（上海安亭科學儀器有限公司）。

1.2 試 藥

龍膽苦苷對照品（純度≧99.9%，批號；100174-2014）；大豆卵磷脂、膽固醇、三氯甲烷（天津博迪化工有限公司）；色譜甲醇（Sigma公司，色譜醇）；其他輔助試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 龍膽苦苷制備方法

精密稱取膽固醇100 mg ，磷脂200 mg，置于250 mL圓底燒瓶中，并加入三氯甲烷25 mL并溶解，再加入含龍膽苦苷

1 mg/mL的pH7.0磷酸鹽緩沖液10 mL，超聲處理15 min，40 ℃水浴減壓蒸發，除去有機溶劑，即可得龍膽苦苷脂質體。

2.2 龍膽苦苷分析方法的建立

2.2.1 色譜條件

LC-20AT C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，粒徑：5 μm）；柱溫為25 ℃；流動相：甲醇-水（30/70，V/V）；體積流量為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；檢測波長為270 nm。

2.2.2 對照品溶液

精密稱取10.05 mg龍膽苦苷對照品，置于10 mL容量瓶內用甲醇溶液并定容，配制成質量濃度每1 mL含1.005 μg的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液

吸取脂質體溶液1 mL于100 mL容量瓶中，加適量甲醇后，超聲15 min。用甲醇定容，既得供試品溶液。

2.2.4 空白對照品溶液

吸取空白脂質體混濁液1 mL于100 mL容量瓶內，加適量甲醇后，超聲15 min。用甲醇定容。

2.2.5 標準曲線的繪制

分別精密吸取儲備液制得質量濃度為5.025，10.05，20.10，

30.15，40.20μg/mL的系列標準溶液。分別取上述溶液10μg進樣，回歸結果顯示，龍膽苦苷面積（A）與其質量濃度（C）在5.025至40.20μg/mL的范圍線性良好，回歸方程為：

A=9.137C+3.853，R=0.9992。

2.2.6 包封率的測定

精密量取1.0 mL龍膽苦苷脂質體樣品液，在10 000 r·min-1轉速的高速離心機中離心30 min之后，取其上清液用0.22 μm濾膜過濾， 按“2.2.1”項下色譜條件，進樣測定藥物游離濃度（C游）。再另外精密量取1.0mL龍膽苦苷脂質體樣品液，加甲醇破乳后用0.22 μm濾膜過濾取其樣品液澄清，按“2.2.1”項下色譜條件測定，即得藥物的總濃度（C總）。

按照下式求算包封率：EE%=（ 1-C游/ C總）×100%平行測定3次，求得平均值。

2.3 星點效應面設計

根據相關文獻資料及預實驗結果確定影響包封率三種主要因素，既大豆卵磷脂與膽固醇用量比（A）、大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比（B）、磷酸緩沖液pH（C）。三個主要因素進行星點設計，大豆卵磷脂與膽固醇用量比（A）分別為1：1、2：1、3：1；大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比（B）分別為25：1、20：1、10：1；磷酸緩沖液pH（C）分別為5.8、7.0、7.8。星點設計及結果，見表1。

采用Design-Expert8.05軟件繪制影響因素與和指標之間的三位效應面結果，如圖1所示。

以大豆卵磷脂與膽固醇用量比（A）、大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比（B）、磷酸緩沖液pH（C）為自變量，包封率（Y）為因變量進行回歸分析。由方差分析可以得出自變量一次項A、B，C、二次項A2、B2顯著（P<0.05）。

選用二次模型，得到多元二次回歸模型為Y=65.37+2.14X1+2.56X2-3.26X3+1.75X1X2-1.68 X1X3+0.68 X2X3-13..85X12-3.45X22+0.99X32（R2=0.9562）；由圖2和Design-Expert 8.05b軟件數據分析得知大豆卵磷脂與膽固醇用量比2.2：1、大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比（B）19：1、磷酸緩沖液pH（C）5.8。

2.4 驗證試驗

確定處方和工藝的條件下制備了3批龍膽苦苷脂質體（批號分別是150401，150402，150403）進行試驗驗證研究，最優處方下的實際包封率為（63.8±2.48）%、（64.5± 1.37）%、（63.1±1.95）%

2.5 理化性質考查

2.5.1 電 鏡

在電鏡下脂質體，脂質體呈規整球形，大多數為單囊結構，形態良好。

2.5.2 粒徑大小及分布

將制的脂質體置于透射電鏡下，觀察粒子形狀及測定粒子大小。結果脂質體粒徑主要分布在于112～450 nm，平均粒徑

178 nm。

3 討 論

龍膽苦苷為水溶性藥物，為了提高親水性其脂溶性，本文采用將龍膽苦苷制備成脂質體的方法，進而提高其生物利用度。脂質體的包封率通常是考察脂質體的重要指標，因此本實驗以包封率為考察指標選擇大豆卵磷脂與膽固醇用量比、大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比、磷酸緩沖液pH為考察因素。

采用星點效應面法得到的最優處方為：大豆卵磷脂與膽固醇用量比2.2：1；大豆卵磷脂與龍膽苦苷用量比19：1；磷酸緩沖液pH值為5.8，超聲10 min，溫度40 ℃。

參考文獻：

[1] 江蔚新，薛寶玉.龍膽對小鼠急性肝損傷保護作用的研究[J].中國中藥 雜志2005，30（14）： 1105- 1107.

[2] 姜少灝，康麗娟，蔣曄，等.龍膽及其復方中龍膽苦苷在大鼠體內的藥動 學研究[J].中國藥學雜志，2005，40（3）：212-215.

[3] 陸彬.藥物新劑型與新技術[M].北京：人民衛生出版社，1998：14.