三唑磷單克隆抗體制備以及酶聯免疫試劑盒的研究

馮才偉，何方洋*，黃健，賈芳芳，李行

（1.北京勤邦生物技術有限公司，北京102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京102206；3.北京市優質農產品產銷服務站，北京100101）

三唑磷單克隆抗體制備以及酶聯免疫試劑盒的研究

馮才偉1，2，何方洋1，2*，黃健3，賈芳芳1，2，李行1，2

（1.北京勤邦生物技術有限公司，北京102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京102206；3.北京市優質農產品產銷服務站，北京100101）

通過三唑磷與乙酰氯反應，得到三唑磷半抗原，通過免疫動物得到抗三唑磷單克隆抗體，將其應用于能夠檢測蔬菜中三唑磷殘留量的酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，結果表明：該試劑盒對結球甘藍中三唑磷的檢測限為49.6 μg/kg，IC50為6.9 μg/L，加樣回收率為70.0%～93.5%，三唑磷標準曲線線性范圍為1～81 μg/L，批內、批間的相對標準偏差（RSD）＜10%，三唑磷單克隆抗體與毒死蜱、對硫磷的交叉反應率分別為2.3%，3.8%。4℃條件該試劑盒下能夠保存12個月，穩定性較好。

三唑磷；單克隆抗體；ELISA試劑盒

三唑磷是一種中等毒性的廣譜有機磷殺蟲劑［1］，作為高效替代農藥已經大量使用多年。但是由于其半衰期較長、容易殘留，環境和食品中其殘留超標的問題逐漸引起關注。因此，建立三唑磷殘留的快速檢測技術，對加強其殘留監測，減少環境污染，保障人體健康具有重要意義［2］。歐盟規定三唑磷作為農藥品種在蜂王漿、花粉等不得檢出（低于0.01 mg/kg），在水果、香菜、小豆蔻、黑胡椒、白胡椒等農產品中限量僅為0.07 mg/kg［3］；我國國家標準GB 2763—2014《食品中農藥最大殘留限量》中規定了三唑磷的最大殘留限量為：蔬菜中結球甘藍、節瓜均為100 μg/kg［4］。

目前，檢測三唑磷的檢測方法有高效液相色譜法［5-6］、氣相色譜法［7-8］、色譜-質譜聯用法和壓電免疫傳感器等［9-11］。這些儀器方法的優點在于靈敏度高，缺點是費用很高，操作也較為復雜，對企業質量內控以及現場監管均具有一定的局限性。相較于其他方法，酶聯免疫吸附法具有靈敏性高、特異性強的優點?；谏鲜鲈?，制備了抗三唑磷單克隆抗體，同時開發了檢測蔬菜中三唑磷殘留量的酶聯免疫吸附測度（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，不僅方便基層檢測機構進行初篩檢查，而且利于生產廠家進行較為高效、快速的自檢。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

三唑磷標準品：北京標準物質研究中心；氫氧化鈉、乙酸乙酯、磷酸鹽、卵清蛋白、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、四甲基聯苯胺、二氯甲烷、三唑磷、乙酰氯、硫酸鎂、羧甲基羥胺（以上均為分析純）：北京百欣試劑公司；蔬菜：市售；復溶工作液、細胞：北京勤邦生物技術有限公司。

1.2儀器與設備

MR3酶標儀：上海雷勃分析儀器有限公司；HFJ-10振蕩器、MX-F渦旋儀：湖南湘立科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1制備抗原

（1）半抗原的制備

將10 mL二氯甲烷和0.5 g三唑磷加入100 mL三口燒瓶，冷藏降溫至-5℃，攪拌下加入1.01 mol/L的乙酰氯，控溫加入2 mol/L的三氯化鋁，控溫5℃反應6 h后，加稀鹽酸和冰水，乙酸乙酯萃取，水洗，無水硫酸鎂干燥有機相，減壓蒸干溶劑，石油醚-乙酸乙酯體系重結晶得乙?；?。

將上步驟獲得的乙酰化物加入100 mL三口燒瓶，再加入10 mL吡啶進行溶解，加入1.2 mol/L的羧甲基羥胺，65℃反應5 h，乙酸乙酯萃取，水洗，無水硫酸鎂干燥有機相，減壓蒸餾，得到半抗原產物，三唑磷半抗原的合成路線見圖1。

圖1　三唑磷半抗原合成途徑Fig.1 Synthesis pathway of triazophos hapten

（2）免疫原的制備

用1 mL二甲基甲酰胺（dimetbylformamide，DMF）溶解12 mg三唑磷半抗原，得到溶液A；用0.2 mL水充分溶解30 mg碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）后，加入溶液A中，室溫下攪拌24 h，即可得到反應液B。稱取牛血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH為7.2）中，將反應液B逐滴緩慢滴加到該蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h，然后在4℃條件下，用0.01 mol/L PBS透析3 d，每天換3次透析液，保存于-20℃。

（3）包被原的制備

包被原制備方法即為：將（2）制備免疫原的牛血清白蛋白替換為卵清蛋白，其他步驟相同。

1.3.2制備酶標記抗抗體

將1.3.1得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內，產生抗血清。取免疫Balb/c小鼠脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞融合，通過間接競爭酶聯免疫法測定細胞上清液，篩選陽性孔，進行克隆化，獲得能夠穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞置于細胞培養基中，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養液進行純化，得到三唑磷單克隆抗體［12］，用該抗體免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體［13］，然后偶聯辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）［14］，得到酶標記抗體。

1.3.3優選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度，制備酶標板

在測定波長為450 nm，抗原稀釋倍數依次為1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000；單克隆抗體稀釋倍數依次為：1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶160 000；酶標記抗抗體液的稀釋倍數為1∶1 000時，分別測定0以及0.05 μg/L質量濃度的三唑磷標準品的吸光度值，并計算百分吸光度值，計算公式如下：

將100 μL抗原包被液包被于酶標板中，37℃孵育2h，然后清洗酶標板，加入150 μL封閉液（封閉液為0.05%牛血清白蛋白（BSA））溶解于0.02 mol/L PBS中，37℃孵育2 h［15］，即制備完成酶標板。

1.3.4蔬菜樣本的前處理方法

稱取2.0 g均質蔬菜樣本至10 mL聚苯乙烯離心管中，分別加入2 mL 0.1mol/L NaOH溶液和10 mL乙酸乙酯，振蕩5 min，混勻；室溫離心5 min，轉速≥3 000 r/min；移取1 mL上層有機相至玻璃試管中；于50～60℃水浴流下氮氣吹干；加入1 mL復溶工作液，渦動1 min。取200 mL加入1 800 mL復溶工作液中，混勻；取50 mL用于分析。

1.3.5酶標板檢測

向1.3制備完成的酶標板中依次加入質量濃度為0、1 μg/L、3 μg/L、9 μg/L、27 μg/L、81 μg/L的標準品溶液，以及1.3.6前處理完成的蔬菜樣本溶液，每孔均為50 mL，再加入抗體液每孔50 mL，室溫避光反應30 min。清洗酶標板，然后每孔加入制備的酶標記抗抗體100 μL，室溫避光反應30 min。清洗酶標板，然后每孔加入50 μL H2O2，再加入每孔50 μL四甲基聯苯胺，室溫避光反應15 min。最后每孔加入2 mol/L H2SO450 μL，測定酶標板孔的OD450nm值。

1.3.6計算蔬菜樣本中三唑磷含量

標準曲線的橫坐標為三唑磷標準品質量濃度（μg/L）的對數值，縱坐標為標準品百分吸光度值，然后將蔬菜樣本的OD450nm代入標準曲線，得到相應的質量濃度，該質量濃度乘以稀釋倍數即為蔬菜樣本中三唑磷殘留量。

1.3.7檢測性能

（1）計算檢出限

分別檢測20份蔬菜空白樣本，利用空白樣本濃度的平均值加上3倍標準差，計算檢出限（limit of detection，LOD），即檢測方法可檢測出的最低被測物濃度［16］。

（2）精密度和準確度

我國國家標準GB 2763—2014《食品中農藥最大殘留限量》中規定了結球甘藍、節瓜中三唑磷的最大殘留限量均為100 μg/kg?！掇r殘辦技術材料要求及審查程序》規定：當ELISA試劑盒檢測有最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）的藥物時，測定回收率的添加質量濃度為0.5× MRL、1×MRL和2×MRL（或1.5×MRL）。因此，本實驗按照上述要求，分別對結球甘藍樣本添加三唑磷，使其質量濃度達到50 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg，測定加標回收率，以此評價該試劑盒的準確度。同時，每個樣本做4個平行，按照上述1.3.3制備3批酶標板，計算相對標準偏差（relativestandard deviation，RSD），以此評價該試劑盒的精密度。

（3）測定穩定性

通過測定試劑盒的保存條件，評價該試劑盒的穩定性。將試劑盒保存于4℃，每個月計算一次0.05 μg/L的標準品在波長450 nm條件下的百分吸光度值（即最大百分吸光度值）、半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）以及結球甘藍樣本的回收率，連續測定12個月，記錄最大百分吸光度值。

（4）測定抗體特異性

毒死蜱、對硫磷與三唑磷的結構類似［17］，測定這三種藥物的IC50，根據下式計算該試劑盒對于毒死蜱、對硫磷的交叉反應率：

2　結果與分析

2.1鑒定半抗原

利用核磁共振氫譜法測定1.2.1制備的半抗原，如圖2所示，11.0 ppm的羧基信號峰、2.85 ppm甲基信號峰的出現，說明半抗原合成成功［18-19］。

圖2　三唑磷半抗原核磁共振氫譜Fig.2 H1NMR of triazophos hapten

2.2優選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度

測定不同單克隆抗體稀釋倍數以及抗原稀釋倍數條件下，質量濃度為0和0.05 μg/L的三唑磷標準品的OD450nm值，結果見表1。

表1　抗原、抗體的濃度優選結果Table 1 Concentration detection results of antigen and antibody

通過我公司多年實驗驗證，當OD450nm（0.05 μg/L）/ OD450nm（0）的抑制率在70%～85%時，以抗原、單克隆抗體的最大稀釋倍數作為抗原、單克隆抗體的最佳稀釋倍數［20］，由表1可見，本研究優選抗原稀釋倍數為2 000，最佳單克隆抗體稀釋倍數為80 000。

2.3標準曲線

以三唑磷標準品質量濃度對數值為橫坐標，以OD450nm（0.05 μg/L）/OD450nm（0）的對數值為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖3。

圖3　三唑磷標準曲線Fig.3 Standard curve of triazophos

由圖3可知，標準曲線線性方程為y=-1.682x+1.516，R2為0.996 2。標準曲線的線性范圍為1～81 μg/L，IC50（半抑制濃度）為6.9 μg/L。

2.4計算檢測限

20個結球甘藍空白樣本中三唑磷的檢測結果見表2。檢測限以測定平均值加3倍標準差計算。

表2　結球甘藍空白樣本檢測限測定結果Table 2 Detection limit results of cabbage blank sample μg/kg

由表2可知，20個結球甘藍樣本中三唑磷的測定結果平均值為18.5 μg/kg，標準差為10.4%，最低檢測限為49.6 μg/kg。

2.5精密度和準確度

測定添加不同質量濃度三唑磷的結球甘藍樣本的精密度及準確度試驗結果見表3。

由表3可知，回收率范圍是70.0%～93.5%，可見當添加質量濃度為50 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg時，批內相對標準偏差范圍是6.9%～9.7%；批間相對標準偏差范圍是7.6%～9.6%?？梢?，批內、批間相對標準偏差分別為6.9%～9.7%、7.6%～9.6%，均＜10%，說明試劑盒精密度和準確度良好。

表3　精密度及準確度試驗結果Table 3 Results of precision and accuracy tests

2.6穩定性

將試劑盒保存在4℃條件下，每月測定最大百分吸光度值、IC50以及回收率，穩定性結果見表4。由表4可知，測定的無添加三唑磷試劑盒的最大百分吸光度值范圍是1.70～1.91，半數抑制濃度范圍是5.1～7.9 μg/L，三唑磷添加回收率范圍是70.9%～92.5%，由此可見，各指標均在正常范圍之內。該試劑盒在4℃至少能夠保存12個月。

表4　試劑盒在4℃保存的穩定性Table 4 Stability of the kit kept at 4℃

2.7抗體特異性的測定

三唑磷抗體與毒死蜱、對硫磷的交叉反應率見表5。

由表5可知，三唑磷抗體與毒死蜱、對硫磷的交叉反應率分別為2.3%、3.8%，交叉反應率低，由此可見，三唑磷抗體特異性良好。

表5　交叉反應率試驗結果Table 5 Experimental results of cross reaction rate test

2.8討論

梁赤周等［17］利用酶聯免疫吸附測度法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒檢測土豆、洋蔥、茄子等樣本中的三唑磷殘留情況，該試劑盒對樣本的添加回收率為65%～125%，變異系數＜15%，在4℃或-20℃的保質期僅為6個月，本研究的樣本回收率為70.0%～93.5%，批內、批間相對標準偏差＜10%，試劑盒在4℃下能夠保存12個月。黃魁英等［21］采用活潑酯法偶聯三唑磷半抗原和蛋白，進而免疫小鼠得到三唑磷多克隆抗體，通過建立ELISA方法，該抗體的IC50為10 μg/L，本研究制備的單克隆抗體IC50為6.9 μg/L。韋林洪等［1］利用免疫親和色譜-高效液相色譜分析稻米中的三唑磷殘留量，該方法的相對標準偏差僅為4.44%，但是總體的操作時間超過24 h，無法作為快速檢測方法用于基層單位。

3　結論

本研究制備了抗三唑磷單克隆抗體，并研發出相應的ELISA試劑盒，優選出抗原包被濃度和單克隆抗體濃度，試劑盒的標準曲線范圍1～81 μg/L，對結球甘藍的檢測限為49.6 μg/kg，回收率為70.0%～93.5%，批內相對標準偏差范圍是6.9%～9.7%，批間相對標準偏差范圍是7.6%～9.6%。三唑磷單克隆抗體的特異性較好，與毒死蜱、對硫磷的交叉反應率分別為2.3%，3.8%。ELISA試劑盒能夠在4℃下保存12個月，主要指標在正常范圍內，可見穩定性較好［22］。

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FENG Caiwei1，2，HE Fangyang1，2*，HUANG Jian3，JIA Fangfang1，2，LI Hang1，2
（1.Beijing Kwinbon Biotechnology Company，Beijing 102206，China；2.Beijing Engineering Research Centre of Food Safety Immunodetection，Beijing 102206，China；3.Beijing Agricultural Products Quality Service Station，Beijing 100101，China）

The synthesized triazophos hapten was prepared from a sequence of reactions of triazophos and acetyl chloride.Triazophos monoclonal antibodies werepreparedfromimmuneanimal，andcouldbeusedinELISAkitthatpreparedfortriazophosresiduecontentdetectioninvegetable.The results showedthatthelimitofdetectionoftriazophosELISAkitwas49.6 μg/kg，withIC50valueof6.9μg/L.Theaddingrecoverieswere70.0%-93.5%，and the linear range of triazopos standard curve ranged from 1-81 μg/L，and intra-assay and relative standard deviation was less than 10%.The cross reaction rate with chlorpyrifos，parathion was 2.3%and 3.8%respectively.The stability tests results revealed that the kit could be kept at 4℃for 12 months.

triazophos；monoclonal antibodies；enzyme linked immunosorbent assay kit

TS207.3

0254-5071（2016）06-0165-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.035

2015-12-16

貴州省重大科技專項（黔科合重大專項字［2013］6024號）

馮才偉（1978-），男，高級獸醫師，碩士，研究方向為食品安全檢測技術研究。

何方洋（1969-），男，高級研究員，博士，研究方向為食品安全檢測技術研究。