養殖大菱鲆腹水病病原菌的分離與鑒定

景亞運， 張 正， 王印庚， 于永翔， 廖梅杰， 李 彬

(1.大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連116023；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所,青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東青島 266071)

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養殖大菱鲆腹水病病原菌的分離與鑒定

景亞運1,2， 張 正2*， 王印庚2， 于永翔2， 廖梅杰2， 李 彬2

(1.大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連116023；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所,青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東青島 266071)

[目的]從養殖大菱鲆中分離腹水病病原菌，并對其進行鑒定。[方法]從山東半島2個不同的養殖場腹水病發病大菱鲆體內分離病原菌，并通過常規生理生化試驗和16S rDNA基因序列對比對其進行鑒定。[結果]共分離到2株優勢細菌。常規生理生化特征分析表明，這2株菌分別與鯊魚弧菌(Vibriocarchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)表性特征非常相似。系統發育樹分析表明這2株菌與鯊魚弧菌(Vibriocarchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)的親緣關系最近。[結論]這2株細菌被鑒定為鯊魚弧菌(Vibriocarchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)。

大菱鲆；腹水病；病原；鯊魚弧菌；大菱鲆弧菌

大菱鲆(ScophthalmusmaximusL)隸屬鲆科菱鲆屬，是水產品市場廣受歡迎的一種名貴魚種，經濟價值很高[1]。我國從1992年開始進行大菱鲆的引種工作，并于2001年開始進行大規模的商業養殖。但是，近幾年隨著大菱鲆養殖熱潮的興起，養殖規模迅速擴大，疾病的暴發也越來越頻繁[2-4]。通過對養殖大菱鲆進行系統的流行病學調查研究，發現腹水病是養殖大菱鲆最為常見的細菌性疾病之一。筆者從3個分布于山東半島不同區域的養殖場采集了病魚的樣品，進行了細菌分離和病原的系統發育學研究。

1　材料與方法

1.1菌種的采集、分離和培養基從位于青島和榮成2個不同的養殖場采集到2個患腹水病的大菱鲆樣品，這2個樣品病魚外觀胸腔鼓脹、腹部隆起，解剖后發現胸腔內部充滿無色或淡黃色液體，腹水病的病變癥狀非常明顯。

在無菌條件下，將發病魚的肝臟組織剪碎后用接種環直接挑取并接種于鹽度為3%的TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)平板培養基上，28 ℃下培養24～30 h后，挑取優勢菌的單個菌落純化2遍后，用20%甘油置于-80 ℃冰箱中保存。腹水中的細菌則是使用一次性無菌醫用注射器吸取少量腹水直接接種于鹽度為3%的TSB平板培養基上，采用相同的方法分離和保存。TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)培養基的成分為：胰蛋白胨17 g，植物蛋白胨3 g，NaCl 30 g，磷酸氫二鉀25 g，葡萄糖25 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃下高壓滅菌15 min。

1.2形態觀察和生理生化試驗使用Nikon E800光學顯微鏡觀察細菌個體形態、大小和鞭毛，用半固體培養基(TSB)穿刺接種培養結合水浸片觀察細菌運動性。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊(第9版)》對細菌進行常規分類，用法國生物梅里埃公司API 20E試劑條和北京陸橋公司的菌種鑒定管進行常見碳、氮源利用和酶反應的測定，對于一些特征性反應則手工配制相應培養基進行。

1.316S rDNA序列測定分析

1.3.1PCR模板的制備。將細菌分別接種于TSB平板上，28 ℃下培養24 h后取單一菌落懸浮于無菌去離子水中，100 ℃水浴5～10 min后，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，上清液即為PCR擴增反應的模板。

1.3.216S rDNA基因序列的PCR擴增和序列測定。16S rDNA基因擴增的正向引物(P27f)為5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTC AG-3’，反向引物(P1429r)為5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(此引物為細菌16S rDNA基因序列擴增的通用引物)。PCR擴增體系(100 μL)：1×PCR緩沖液、1.5 mmol/L MgCl2、4×dNTP混合物125 μmol/mL、引物各7.5 nmol/mL、TaqDNA聚合酶1 μL (5 U/μL)、1 μL DNA原液。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸100 s，35個循環；最后72 ℃溫育15 min。PCR產物經過瓊脂糖電泳確定特異條帶后，直接交由上海生物工程技術公司進行PCR產物純化和序列測定。

1.3.3序列分析和系統發育樹的構建。將所獲得的16S rDNA基因序列使用BIOEDIT軟件進行對比分析，確定其相似性。從GenBank中選取與其相似率最高的細菌16S rDNA基因序列，使用BIOEDIT軟件中集成的Clustal W軟件進行多序列匹配排列，使用系統發生推斷軟件包PHYLIP3.6a3進行統計和聚類分析。采用鄰位相連法(Neighbor-joining)獲得系統發育樹，通過自舉分析(Bootstraping)進行系統進化樹的評估，自舉數據集為1 000次。

1.3.4構建系統發育樹的16S rDNA基因序列來源。從GenBank數據庫中選取25株與分析細菌的16S rDNA基因序列相似性較高的已鑒定至種的菌株，與分離到的菌株共同構建系統發育樹。選取菌株的相關數據和存取號見表1。

表1　構建系統發育樹的16S rDNA基因序列及其數據庫存取號

2　結果與分析

2.1形態特征和運動性從這2個病魚樣品中分離到2株優勢細菌，分別編號為菌株Ⅶ和菌株Ⅸ。這2株菌在鹽度3%的TSB培養基上28 ℃下培養24～30 h后，形成的單個菌落均較小、透明、接近無色。水浸片顯微檢查和半固體瓊脂穿刺接種培養都發現菌株Ⅶ有較強的運動性，菌株Ⅸ沒有明顯的運動性。在TCBS瓊脂平板培養基上，菌株Ⅶ和菌株Ⅸ都呈明顯黃色的菌落。

2.2生長特性這2株菌的溫度生長范圍存在差異，菌株Ⅶ在10～40 ℃范圍內都能生長，并且在此范圍內沒有表現太大的生長速度差異。菌株Ⅸ在10～30 ℃范圍內能良好地生長，在30～40 ℃范圍內可以微弱生長。

在鹽度1%～5%的范圍內，這2株細菌生長非常良好，在此范圍外表現出一定的鹽度生長差異性。當pH高于6.5時，它們都能夠良好生長，說明這2株細菌都是嗜堿性的。

2.3生理生化特征由表2可知，這2株細菌明顯不是同一種細菌。它們在 TCBS平板生長旺盛，且菌落都呈明顯黃色，對O/129特征性抑制劑敏感，據此可將它們歸為弧菌屬細菌。通過查閱相關文獻發現，菌株Ⅶ在一些主要指標上與鯊魚弧菌(Vibriocarchariae)非常相近，菌株Ⅸ與大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)的生理生化特征非常相似。

表2　分離菌株的主要生理生化特征

注：+ 表示陽性；- 表示陰性；(+)表示弱陽性生長[5]。

Note：+ indicated positive; - indicated negative; and (+) indicated the growth of weak positive[5].

2.416S rDNA基因序列分析和系統發育樹的構建將獲得的16S rDNA序列使用DNAMAN軟件進行比對，發現它們的相似率為93.98%。綜合上述生理生化試驗結果，可以確定這2株細菌同屬不同種。將這2株細菌的16S rDNA基因序列分別輸入NCBI GenBank數據庫中進行相似性檢索，結果發現與菌株Ⅶ相似性最高的前100個序列中65%為弧菌屬細菌，與其最相近的已鑒定的細菌16S rDNA序列是鯊魚弧菌(Vibriocarchiariae)的16S rDNA序列，相似率為99.71%。與菌株Ⅸ相似性最高的前100個序列中84%為弧菌屬細菌，與其相似率最高的已鑒定的細16S rDNA序列是大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)的16S rDNA序列，相似率為99.37%。

從GenBank數據庫中選取與菌株Ⅶ和菌株Ⅸ的16S rDNA序列相似性較高的13株細菌的16S rDNA序列(表1)進行系統發育學分析，并構建系統發育樹。從圖1可以看出，B7(菌株Ⅶ)與V.carchiariae自然聚類成一個分支，B9(菌株Ⅸ)與V.scophthalmi自然聚類成一個分支[6]。綜合生理生化試驗結果和16S rDNA系統發育學分析，可初步鑒定這2株從患腹水病的大菱鲆體分離到的優勢細菌中1株為鯊魚弧菌(Vibriocarchiariae)，另1株為大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)。

注：基于16S rDNA基因序列用鄰位相連法完成，分枝上的數字是1 000次重復抽樣檢測的Bootstrap值。　Note: Based on 16S rDNA sequence with Neighbor-joining method, the digit on the ramification was bootstrap valuation of 1 000 replications of sampling detection.圖1　16S rDNA基因序列的聚類分析結果Fig.1　Cluster analysis result of 16S rDNA gene sequence

3　討論

流行病調查表明，腹水病是養成期大菱鲆的常見疾病，流行面積較廣，在環渤海沿岸和山東半島以及江蘇省等大菱鲆的主要養殖區都發生過。對腹水病的病原學初步研究表明，細菌是導致腹水病發病的主要原因。腹水病發病初期屬于內臟器官的病變，發病中后期則會導致全身感染，并可導致大規模的死亡，發病后具有非常典型的外觀病變特征，在養殖生產中若注意觀察是比較容易發現和識別的[7]。

腹水病屬于內臟器官的病變，其發病機理是比較復雜的[8]。針對來源不同的樣品，對腹水病進行的細菌分離也證實了這一點。從腹水病發病病魚的內臟組織和腹腔積水中分離到鯊魚弧菌和大菱鲆弧菌，此外還有1株待鑒定的細菌。從病原學研究來看，推測腹水病可能是多種病原都能致病。

鯊魚弧菌是國外的一些相關文獻報道的對大菱鲆致病的常見病害細菌之一[9]，國內莫照蘭等[10]也報道了鯊魚弧菌可對養殖牙鲆致病。目前在我國對養殖大菱鲆的病害研究還相對較少，盡管已經從發病的大菱鲆體內檢測到鯊魚弧菌，并已證實在腹水病患病狀態下這種弧菌屬于優勢菌群，但對于這2種弧菌的入侵方式、致病力以及是原發病原還是繼發病原都尚需深入研究。據國外文獻報道，大菱鲆弧菌是大菱鲆幼苗期腸道中占優勢數量的一種細菌，正常情況下并無致病性[11]。在來自不同地理區域的大菱鲆樣品腸道中都可檢出大菱鲆弧菌；在一些育苗場的水體中和活餌體內，也曾檢出大菱鲆弧菌，但在養殖池底的沉積物中并不常見[12]。因此，推斷大菱鲆弧菌可能是健康大菱鲆腸道中的正常優勢菌群，但在大菱鲆內臟器官被感染或其他病原細菌入侵后可能轉變為條件致病菌，應屬于繼發性病原。但是對于該菌一些病原學方面的具體特性還有待進一步研究。此外，在來自其他地區的患腹水病的大菱鲆樣品中還分離到1株已證實為非弧菌屬的細菌，通過對其生理生化特征和16S rDNA基因序列的研究，并未找到相似性很高的已知菌種，今后對這株細菌的鑒定和相關病原學方面的研究也將逐漸開展。

由于試驗成本和試驗條件的限制以及腹水病的發病機理本身具有復雜性，尚未完成對腹水病的人工回接感染試驗。該試驗中所分離的這些細菌來自不同的養殖場，具有一定的代表性，它們極有可能是這2種疾病的第一致病原或繼發性病原。根據這些細菌的多樣性推測，它們也存在聯合致病的可能性。腹水病是大菱鲆養殖過程中極為常見的一種細菌性疾病，由于是內部器官的感染，發病前期沒有明顯的癥狀，給生產上及時發現和預防該病造成了一定的困難[13]。因此，選購健康的苗種、規范健康養殖工藝和加強衛生操作管理防治腹水病的有效措施。

[1] 雷霽霖，劉新富.大菱鲆Scophthalmusmaximus引進養殖的初步研究[J].現代漁業信息，1995，10 (11): 1-3.

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Isolation and Identification of Pathogenic Bacterium Associate with Ascites Disease of CulturedScophthalmusmaximus

JING Ya-yun1,2, ZHANG Zheng2*,WANG Yin-geng2et al

(1. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian, Liaoning 116023; 2.Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao, Shandong 266071)

[Objective] To isolate and identify pathogenic bacterium associate with ascites disease of culturedScophthalmusmaximus. [Method] Pathogenic strains were isolated from three diseased-turbot samples associate with ascites syndrome in three different aquatic plants on Shandong Peninsula. The traditional physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequencing analysis were performed on the two strains. [Result] A total of two dominant bacterium were isolated. Analysis of traditional physiological and biochemical test showed that the two strains wereVibriocarchiariaeandVibrioscophthalmi. Analysis of phylogenetic dendrogram showed that the two strains had close genetic relationship withVibriocarchiariaeandVibrioscophthalmi. [Conclusion] The two strains were identified asVibrioalginolyticusandVibrioscophthalmi.

Scophthalmusmaximus; Enteritis diseases; Pathogeny;Vibrioalginolyticus;Vibrioscophthalmi

山東省自主創新與成果轉化專項(2014ZZCX06205)。

景亞運(1990- )，男，河北任丘人，碩士研究生，研究方向：海水養殖病害研究。*通訊作者，副研究員，博士，碩士生導師，從事海水養殖病害研究。

2016-06-29

S 94

A

0517-6611(2016)24-106-03