10億芽孢/g解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的研究

倪 榮,李紫嫣,鐘文文,張海娟,許俊杰

(臨沂大學藥學院，山東臨沂 276000)

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10億芽孢/g解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的研究

倪 榮,李紫嫣,鐘文文,張海娟,許俊杰*

(臨沂大學藥學院，山東臨沂 276000)

[目的]初步確定解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的制備工藝。以解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1為研究對象，對填料、潤濕劑、分散劑、穩定劑、UV保護劑進行篩選。[結果]其工藝配方為：硅藻土10%為填料，PVA 7.2%為分散劑，D425 4.8%為潤濕劑，CMC-Na 2.0%為穩定劑，FWA 0.1%為保護劑。該粉劑的芽孢含量達1.2×109cfu/g，懸浮率為80%，潤濕時間為47 s，熱貯分解率為23.2%。[結論]該制劑質量符合相關要求，可進一步研究。

解淀粉芽孢桿菌；可濕性粉劑；穩定性；研制

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的革蘭氏陽性芽孢桿菌[1-3]。芽孢桿菌是自然界中廣泛存在的一種非致病菌，容易形成對惡劣環境(物理的或化學的)具有較高耐性的芽孢，具有耐熱、耐旱、抗紫外線等優點，對溫度、pH等物理及化學因素的耐受性高于營養細胞，是用來研制可濕性粉劑的首選材料。微生物農藥是指利用生物活體殺死或抑制植物病原微生物生長的制劑，具有環境兼容性好、毒副作用小等優點，既可殺死或抑制病原微生物，又可保護生物多樣性，是當今農藥產業發展的趨勢。鑒于此，筆者以解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1菌株為研究對象，通過助劑選擇和配制工藝優化，研制了符合國標的10億芽孢/g解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑，以期為該菌的應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1篩選材料。解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1菌株由臨沂大學藥學院實驗室保存。解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1搖瓶發酵液，芽孢含量≥5.0×109cfu/mL，芽孢率≥90%。制劑加工材料：解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1 50 L發酵罐發酵液，芽孢含量≥1.0×1010cfu/mL，芽孢率≥90%。

1.1.2載體。白炭黑(28 μm)、高嶺土(10 μm)、硅藻土(18 μm)、滑石粉(18 μm)、膨潤土(45 μm)、輕質碳酸鈣(10 μm)購于北京華瑞博遠科技發展有限公司。

1.1.3助劑?？s聚萘磺酸鹽(D110)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG 8000)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、烷基萘磺酸縮聚物鈉鹽(Morwet D-425)、吐溫-80等購于天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.1.4穩定劑。CaCO3、K3PO4、K2HPO4、CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)購自天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.1.5紫外保護劑。抗壞血酸(VC)、羧甲基纖維素(CMC)、糊精和熒光增白劑(FWA)購于天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.1.6主要儀器。QS-50型氣流粉碎機(上海細創粉體裝備有限公司)、DS-1500型噴霧干燥機(上海沃迪科技有限公司)、臺式離心機(北京時代天誠科技有限公司)、恒溫培養箱(上海精宏試驗設備有限公司)、精密酸度計(德國賽多利斯科學儀器廠)、恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)。

1.2方法

1.2.1制劑芽孢含量的測定。采用平板菌落計數法，測定制劑的芽孢含量。

1.2.2制劑加工工藝與方法。

1.2.2.1篩選試驗加工工藝。先將解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1搖瓶發酵液與填料按一定比例混合制成母液，置于鼓風干燥機干燥制成母粉。在母粉中添加一定比例的分散劑、潤濕劑等，然后經氣流粉碎機粉碎制得可濕性粉劑。

1.2.2.2制劑加工工藝。將解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1 50 L發酵液與填料按一定比例混合制成母液，經噴霧干燥機干燥制成母粉。在母粉中添加一定比例的分散劑、潤濕劑等，然后經氣流粉碎機粉碎制得各種不同的制劑。

1.2.2.3初始制劑成分配比。初始制劑成分質量配比為發酵液70.0%，填料10.0%，助劑10.0%，穩定劑2.0%，保護劑0.1%，白炭黑補足100%。

1.2.3 篩選試驗。

1.2.3.1填料的篩選。選擇白炭黑、高嶺土、硅藻土、膨潤土、滑石粉、輕質碳酸鈣6種不同載體做填料，比較不同填料對制劑理化性質的影響。將制備的各制劑室溫貯藏14 d后測定芽孢含量，以此考察填料對芽孢桿菌的生物相容性。綜合考慮各制劑懸浮率、潤濕時間、吸附容量、價格等因素，篩選出最適填料。

1.2.3.2潤濕劑與分散劑的篩選。在母粉中分別添加一定量的PVA、D425等助劑，再按初始量添加K3PO4、VC后混合均勻，即制得不同的制劑。測定各制劑的懸浮率，比較各種分散劑的分散效果；懸浮率越高，分散性越好。測定潤濕時間，比較潤濕性能的好壞；潤濕時間越短，潤濕性越好。根據試驗結果確定最佳的分散劑、潤濕劑。將從助劑中篩選出的分散劑與潤濕劑，分別按質量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1比例經粉碎機混合均勻，測定其懸浮率和潤濕時間，篩選出復配助劑的最佳配比。將復配助劑的用量按2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%和18%分別進行試驗，選出制劑懸浮率與潤濕時間最好的一組，作為復配助劑的用量。

1.2.3.3穩定劑的篩選。將不同的穩定劑添加到母粉中，制得各種不同的制劑，將其分別進行熱貯[(54±2)℃，14 d]試驗，測定其芽孢含量的變化。以不加穩定劑作對照，每個處理重復3次。

1.2.3.4保護劑的篩選。將篩選出的填料、發酵液、濕潤劑及分散劑分別與待選保護劑(0.1%)加工成可濕性粉劑，以不加保護劑為對照，稀釋后涂布在平板上，每個處理重復3次，在距離254 nm紫外燈(20W)40 cm處照射12、24 h后，計算芽孢存活率。

將保護劑添加到母粉中，制得各種不同的制劑，將其分別稀釋后涂布在平板上，置于距離(254 nm，20 W)紫外燈40 cm處照射12、24 h后，計算存活率。以不加保護劑作對照，每個處理重復3次。

1.2.4水分含量對制劑穩定性的影響試驗。選擇不同含水量的解淀粉芽孢桿菌制劑100 g，37 ℃下鼓風干燥，得到含水率分別為2%、5%、7%、9%和13%的樣品，將樣品分別密封后，進行熱貯[(54±2) ℃，14 d]試驗后測定芽孢含量，并計算芽孢存活率。

1.2.5制劑貯藏穩定性測定。分別取100 g解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑置于冷藏[(4±2) ℃]和室溫(25 ℃)條件下貯存，每1個月測定1次樣品的芽孢含量，測定時長360 d，共測定11次，以此確定制劑貯存360 d期間芽孢含量的變化。

1.2.6制劑的指標測定。采用平板菌落計數法，測定制劑的芽孢含量。按照《中華人民共和國國家標準》對解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑進行測定[4]。

2　結果與分析

2.1填料的篩選可濕性粉劑中的填料對制劑的理化性質影響很大。農藥原藥為液態的制劑，選擇吸附容量高的填料對制劑加工非常重要；如果是固體原藥，則選擇吸附容量適宜的填料即可。

表1　填料對制劑理化性質的影響

由表1可知,白炭黑吸附容量最大，其次是硅藻土，但是白炭黑流動性比硅藻土好，且解淀粉芽孢桿菌與白炭黑混合后的制劑芽孢含量在室溫下貯藏14 d后，發現芽孢含量明顯下降，說明白炭黑與芽孢桿菌的生物相容性較差，且白炭黑價格偏高，所以選擇硅藻土作為填料。

2.2助劑的篩選大部分分散劑具有一定程度的潤濕作用，而大部分潤濕劑又具有一定程度的分散作用，因此，該研究對助劑的懸浮作用和潤濕作用同時考察。

由表2可知，雖然以表面活性劑CMC-Na為分散劑，制劑的懸浮率最高，達到87%，但其潤濕時間卻高達300 s，故選擇PVA作分散劑。而以D425作潤濕劑濕潤時間為8 s，其懸浮率達73%，故選擇D425作潤濕劑。因此，選擇PVA與D425復配。

由表3可知，采用PVA與D425復配質量比為6∶4時，其制劑的懸浮率與潤濕時間均較佳。由表4可知，隨助劑用量降低，懸浮率與潤濕性均下降，為保證制劑成本和質量，確定復配助劑用量為12%，由此確定PVA用量為7.2%，D425用量為4.8%。

表3助劑配比對制劑理化性質的影響

Table 3Effects of assistant ratio on physical and chemical properties of preparations

PVA-D425質量比PVA-D425massratio細度Fineness(44μm)∥%懸浮率Suspensibility%潤濕時間Wettingtime∥s1∶9987592∶89876113∶79877114∶69879125∶59880126∶49882147∶39883158∶29885169∶1988617

表4助劑用量對制劑理化性質的影響

Table 4Effects of assistant dosage on physical and chemical properties of preparations

助劑量Assistantdosage∥%細度Fineness(≤44μm)∥%懸浮率Suspensibility%潤濕時間Wettingtime∥s29857454986337698682889875231098841412988612149888121698901018989111

2.3穩定劑的篩選加入適量的穩定劑，不但能提高制劑的穩定性，還能提高其潤濕性和滲透性。由表5可知，在4種穩定劑中，加入CMC-Na作為穩定劑，熱貯后解淀粉芽孢桿菌的存活率最高。此外，CMC-Na具有分散劑的作用，所以選擇CMC-Na作為穩定劑，制劑的懸浮率也較高。

表5　熱穩定劑對制劑理化性質的影響

2.4UV保護劑的選擇由于解淀粉芽孢桿菌施用到大田中，陽光中的紫外線直接對活菌體構成了威脅，因此，有必要在可濕性粉劑中加入UV保護劑。UV保護劑能將陽光中的大部分紫外輻射吸收掉，將吸收的能量轉化為無害的熱能散發到空氣中。

由表6可知，制劑添加FWA作UV保護劑，UV照射處理24 h后芽孢存活率最高，達57.6%，因此，選擇FWA作為UV保護劑。

表6　UV保護劑對制劑理化性質的影響

2.5 水分含量對制劑穩定性的影響解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑在不同的貯藏條件下放置一定時間后，芽孢數量會發生不同程度的變化，其數量和耐貯藏時間的長短直接決定產品的優劣。水分含量與菌體生長代謝密切相關。水分含量過高，菌體代謝活躍，貯藏期間死亡率高，此外還造成制劑的流動性差、黏結成團，影響到制劑的質量和使用效果；水分含量較低，菌體處于休眠狀態，能夠延長制劑的貯藏時間。

由圖1可知，水分含量對熱貯后芽孢存活率有顯著影響。水分含量高于6.5%時，制劑熱貯后芽孢存活率低于70.5%，制劑質量較差。 因此，制備解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑，水分含量不宜超過6.5%。

圖1　解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的水分含量對存活率的影響Fig.1　Effects of water content in Bacillus amyloliquefaciens wetable powder on survival rate

2.6制劑貯藏穩定性測定由表7可知，解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑在室溫下貯藏芽孢存活率明顯比冷藏條件下低。解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑在室溫環境下貯藏360 d后，其芽孢存活率為56.5%，而在(4±2) ℃低溫下保存360 d，其存活率高達80.2%，主要由于較低溫度下芽孢桿菌幾乎全部處于休眠狀態，代謝緩慢。因此，解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑應在盡可能低溫度的環境下保存，有利于延長其貯藏期。

表7解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的貯藏期菌量變化

Table 7Changes of bacterial biomass in the storage period of Bacillus amyloliquefaciens wetable powder

儲存時間Storagetime∥d存活率Survivalrate∥%25℃室溫下Under25℃roomtemperature(4±2)℃冷藏(4±2)℃coldstorage098.098.05096.598.010090.096.215085.694.320076.992.825068.190.230063.489.135058.686.336056.580.2

2.7可濕性粉劑的指標測定測定結果表明，該粉劑的芽孢含量達1.2×109cfu/g，懸浮率為80%，潤濕時間為47 s，熱貯分解率為23.2%。制劑質量符合相關要求。

3　結論與討論

通過對填料、潤濕劑、分散劑、穩定劑、紫外保護劑的篩選，確定解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑最佳配方為硅藻土10%、PVA 7.2%、D425 4.8%、CMC-Na 2%、FWA 0.1%，在該條件下制備的解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑芽孢含量高達2.0×109cfu/g，懸浮率為80%，潤濕時間為47 s，熱貯分解率為23.2%。水分含量不宜超過6.5%，復配助劑用量為12%。制劑質量符合相關要求，其他方面有待于進一步研究。

該研究所制備的解淀粉芽孢桿菌lyxjj-1可濕性粉劑芽孢含量與目前大多數市售產品相比，其芽孢含量較高，為我國解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑產品質量的提升奠定了技術基礎。解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布十分廣泛，同時能夠對多種真菌與細菌產生抑制作用，并且具有豐富的自身代謝產物，因此，在生物防治方面具有廣闊的應用前景，可以適當地代替傳統的化學農藥。注冊主要成分為解淀粉芽孢桿菌的生物農藥將被廣泛應用[5-6]。

[1] CRANE J M，GIBSON D M，VAUGHAN R H,et al.Iturin levels on wheat spikes linked to biological control of fusarium head blight byBacillusamyloliquefaciens[J].Phytopathology,2013,103(2):146-155.

[2] 劉京蘭,薛雅蓉,劉常宏.內生解淀粉芽孢桿菌CC09產Iturin A搖瓶發酵條件優化[J].微生物學通報,2014,41(1):75-82.

[3] 車曉曦,李校堃.解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的研究進展[J].生物技術,2010(3):7-10.

[4] 王劍,王楠,高觀朋,等.200億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的研制[J].農藥,2010,49(7):486-489.

[5] 關曉歡,姜華.解淀粉芽孢桿菌研究進展[J].生物技術世界,2013(1):7-9.

[6] 明亮,陳志誼,儲西平,等.生物農藥劑型研究進展[J].江蘇農業科學,2012,40(9):125-128.

Research on Wetable Powder ofBacillusamyloliquefacienswith Each Gram 1 Billion Spores

NI Rong,LI Zi-yan,ZHONG Wen-wen,XU Jun-jie*et al

(School of Pharmacy,Linyi University,Linyi,Shandong 276000)

[Objective] The aim was to determine the preparation technique ofBacillusamyloliquefacienswetable powder.[Method] WithBacillusamyloliquefacienslyxjj-1 as study object,filler,wetting agent,dispersing agent,stabilizer,UV protective agent were selected.[Result] The optimal formulation were confirmed as follows:the content filler diatomite,dispersing agent PVA,wetting agent D425,stabilizer CMC-Na,UV protection agents FWA were 10%,7.2%,4.8%,2.0% and 0.1% respectively.The quality detection showed that the spores content ofB.amyloliquefacienslyxjj-1 wetting powder could come up to 1.2×109cfu/g,and suspension rate of the production was 80%,and the dispersion time was 47 s and thermal decomposition rate of storage was 23.2%.[Conclusion] The quality of the preparation is in accordance with the relevant requirements,which can be further studied.

Bacillusamyloliquefaciens; Wetable powder; Stability; Research

大學生創新創業訓練計劃項目(201410452017，201510452017)。

倪榮(1992- )，女，山東郯城人，本科生，專業：制藥工程。*通訊作者，副教授，博士，從事微生物分離與鑒定及生物農藥研究。

2016-06-06

TQ 450.6

A

0517-6611(2016)24-111-04