草豆蔻有效成分的半制備型高效液相色譜分離

王延翠， 李愛峰， 孫愛玲， 柳仁民

(聊城大學化學化工學院，山東聊城 252059)

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草豆蔻有效成分的半制備型高效液相色譜分離

王延翠， 李愛峰， 孫愛玲， 柳仁民*

(聊城大學化學化工學院，山東聊城 252059)

[目的]建立從草豆蔻中分離純化4種主要有效成分半制備型高效液相色譜法。[方法]使用C18柱(250 mm×25.4 mm I.D.，10 μm)，考察了流動相的組成、流速和上樣量對分離效果的影響，確定適宜的色譜條件；按制備型色譜條件進行洗脫，根據檢測信號在線收集產品流出液，分離所得的餾分經HPLC法進行純度檢測。[結果]適宜的色譜條件是：流動相為甲醇-水梯度洗脫，流速為25 mL/min，上樣量為232 mg，檢測波長為300 nm。經過一次分離即可得到4種成分，經紫外光譜和核磁共振波譜鑒定4種成分分別為山姜素、松屬素、小豆蔻明和榿木酮，經高效液相色譜檢測純度分別為98.7%、99.3%、98.4%和99.1%。[結論]與傳統的分離方法相比，該方法具有高效、簡便、快速的特點，適用于草豆蔻中主要有效成分的快速制備。

半制備型高效液相色譜；草豆蔻；有效成分；分離

草豆蔻為姜科植物草豆蔻AlpiniakatsumadaiHayata的干燥近成熟種子團，氣香，味辛，微苦，具有燥濕健脾、溫胃止嘔的作用，臨床上廣泛用于治療寒濕內阻、脘腹脹滿冷痛、噯氣嘔逆、不思飲食等癥[1]。草豆蔻的主要化學成分為黃酮和雙苯庚酮類化合物，其中山姜素、松屬素、小豆蔻明和榿木酮的含量最高。作為草豆蔻質量控制的主要指標，上述4種物質具有抗炎、抑菌、降血糖、抗氧化、抗輻射、抗癌、抗腫瘤以及增強免疫力等多種藥理作用[2-4]。

近年來，隨著對植物的化學成分和藥理研究的不斷深入[5-7]，關于草豆蔻中活性成分的分離純化研究也日益增多，其中硅膠柱層析是廣泛采用的方法[8]，但該法具有不可逆吸附嚴重、操作繁瑣等缺點。李愛峰等[9]曾使用高速逆流色譜分離純化草豆蔻中的山姜素和小豆蔻明，但該法在選擇兩相溶劑系統時缺乏理論指導。因此建立一種相關成分的高效分離純化方法具有十分重要的意義。該研究建立半制備型高效液相色譜(semi-preparative high performance liquid chromatography,SP-HPLC)從草豆蔻中分離得到4種化合物的新方法，一次分離即可得到4種成分，利用紫外光譜和核磁共振波譜對4種成分進行結構鑒定，利用高效液相色譜對其純度進行測定。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器。Gelaipu高效液相色譜系統(成都格萊普科技有限責任公司)，包括GLP3250高壓輸液泵、UV-3292紫外檢測器及格萊普色譜工作站；Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，包括G1311A高壓輸液泵、G1315B DAD檢測器、G1332A在線脫氣機和安捷倫HPLC色譜工作站；Mercury Plus 400 NMR核磁共振儀(美國瓦里安公司)。 C18柱(250 mm×25.4 mm I.D.,10 μm，成都格萊普科技有限責任公司)，Spherigel ODS C18柱(250 mm×4.6 mm I.D.,5 μm，大連江申分離科學技術公司)。

1.1.2主要試劑。用于草豆蔻中有效成分提取的溶劑(甲醇、乙醇)為分析純(天津市化學試劑三廠)，用于SP-HPLC分離純化和HPLC分離分析的甲醇為色譜純(山東禹王實業有限公司禹城化工廠)，試驗用水為二次蒸餾水。

1.1.3主要藥材。草豆蔻藥材購于聊城市利民大藥店，經鑒定為姜科植物AlpiniakatsumadaiHayata的干燥近成熟種子團。

1.2方法

1.2.1粗提物的制備。稱取草豆蔻藥材50 g，粉碎至30目，用10倍量70%乙醇超聲提取3次，每次30 min，將提取液過濾、合并，減壓濃縮得粗提物3.5 g，用60 mL甲醇溶解，經0.45 μm濾膜過濾，備用。

1.2.2試驗方法。取一定量草豆蔻粗提物進行制備型高效液相色譜分離，按制備型色譜條件進行洗脫，根據檢測信號在線收集產品流出液，分離所得的餾分經HPLC法進行純度檢測。化合物的結構經UV及NMR得以鑒定。試驗中改變流動相的組成，以尋求較短的操作周期以及相鄰組分間合理的分離度；通過改變流動相流速，尋求最佳的洗脫液流速，保證較高的分離效率；通過改變上樣量尋求最佳的處理能力，保證較高的產量。

2　結果與分析

2.1HPLC分析條件的優化在研究過程中首先應建立合適的分析方法對草豆蔻藥材的提取物和分離純化過程中得到的單體成分進行分析。該研究使用Spherigel ODS C18柱(250 mm×4.6 mm I.D.,5 μm)，考察了流動相的組成及洗脫模式對分離效果的影響。結果表明，當使用甲醇-水為流動相進行梯度洗脫(0～25 min,60%～90%甲醇)時，4種目標化合物可以獲得良好的分離。對4種目標化合物的紫外光譜進行掃描，發現在300 nm均具有較強的吸收，因此選擇300 nm 為檢測波長。在上述條件下，草豆蔻粗提物的HPLC圖如圖1所示。

注：1. 山姜素；2. 松屬素； 3. 小豆蔻明；4. 榿木酮。Note:1. Alpinetin; 2. Pinocembrin; 3. Cardamonin; 4. Alnustone. 圖1　草豆蔻粗提物的HPLC圖Fig.1　HPLC chromatograms of the crude extract from A. katsumadai

2.2SP-HPLC分離條件的優化

注：a.甲醇-水 (70∶30,V/V)等度洗脫; b.甲醇-水梯度洗脫 (0～25 min,70%甲醇;25～26 min,70%～90%甲醇; 26～45 min,90%甲醇); c. 甲醇-水梯度洗脫(0～20 min,75%甲醇; 20～21 min,75%～90%甲醇; 21～40 min,90%甲醇); d.甲醇-水梯度洗脫 (0～14 min,80%甲醇; 14～15 min,80%～90%甲醇; 15～30 min,90%甲醇)。1.山姜素；2.松屬素；3.小豆蔻明；4.愷木酮。Note:1. Alpinetin; 2. Pinocembrin; 3. Cardamonin; 4. Alnustone. a. Methanol-water(70:30,V/V) isocratic elution; b. Methanol-water gradient elution(0-25 min,70% methanol,25-26 min,70%-90% methanol; 26-45 min,90% methanol); c. Methanol-water gradient elution(0-20 min,75% methanol; 20-21 min,75%-90% methanol; 21-40 min,90% methanol); d. Methanol-water gradient elution(0-14 min,80% methanol; 14-15 min,80%-90% methanol; 15-30 min,90% methanol). 圖2　流動相的組成及洗脫模式對分離效果的影響Fig.2　Effects of composition and elution mode of the mobile phase on separation

2.2.1流動相的組成。采用C18柱，在上樣量58 mg(含58 mg粗提物)、流動相的流速25 mL/min、檢測波長300 nm的條件下，考察了流動相的組成及洗脫模式對分離效果的影響。結果發現，采用70%甲醇為流動相，榿木酮的保留時間太長(圖2a)，若前3種物質洗脫出來以后改用90%甲醇為流動相，可以使榿木酮的保留時間明顯縮短(圖2b)。分別使用70%、75%、80%甲醇為流動相，考察了甲醇的比例對于前3種物質分離效果的影響(圖2b～d)，發現當75%甲醇為流動相時，它們的分離度及分離時間均比較理想。因此，確定較適宜的洗脫條件為：甲醇-水梯度洗脫(0～20 min,75%甲醇; 20～21 min,75%～90%甲醇; 21～40 min,90%甲醇)。2.2.2流動相的流速。使用C18柱，甲醇-水梯度洗脫(0～20 min,75%甲醇; 20～21 min,75%～90%甲醇; 21～40 min,90%甲醇)，上樣量為58 mg，檢測波長為300 nm，考察了流動相的流速對分離效果的影響。結果表明(圖3)，當流速為25 mL/min時，分離度及分離時間均比較適宜，此時柱壓也不會太大。因此，選擇25 mL/min作為最佳流速。

2.2.3上樣量。制備型HPLC為了提高柱產量，一般采用柱超載方式進行操作。通常可以采用2種操作方式來提高處理量：一種是質量超載，即上樣體積相同，但增加樣品的濃度；另一種是體積超載，即保持樣品濃度一定，增加上樣體積。該研究采用體積超載方式，在保證樣品溶液濃度為58 mg/mL的條件下，考察了上樣體積對分離效果的影響。結果表明(圖4)，隨著上樣量的增加，相鄰兩組分間的分離度減小，當上樣量到達一定量時，相鄰組分無法分離。在58～232 mg范圍內，隨著上樣量的增大，山姜素和松屬素的分離度逐漸減小，色譜峰的不對稱性增大；當上樣量>232 mg時，兩組分重疊嚴重，無法保證目標組分的純度。因此選擇上樣量為232 mg，既可以保證產品的純度，又能提高產量。

注：a.15 mL/min; b.20 mL/min; c.25 mL/min; d.30 mL/min。1.山姜素；2.松屬素；3.小豆蔻明；4.榿木酮。Note:a. 15 mL/min; b. 20 mL/min; c. 25 mL/min; d. 30 mL/min. 1. Alpinetin; 2. Pinocembrin; 3. Cardamonin; 4. Alnustone. 圖3　流動相的流速對分離效果的影響Fig.3　Effects of the flow rate of mobile phase on separation

注：a.58 mg；b.116 mg;c.174 mg;d.232 mg;e.290 mg。1.山姜素；2.松屬素;3.小豆蔻明；4.榿木酮。Note:a. 58 mg; b. 116 mg; c. 174 mg; d. 232 mg; e. 290 mg. 1. Alpinetin; 2. Pinocembrin; 3. Cardamonin; 4. Alnustone. 圖4　上樣量對分離效果的影響Fig. 4　Effects of sample loading on separation

2.2.4SP-HPLC分離純化草豆蔻中的活性成分。綜上所述，使用C18柱分離純化草豆蔻中活性成分的最佳試驗條件為：甲醇-水為流動相梯度洗脫(0～20 min，75%甲醇；20～21 min，75%～90%甲醇；21～40 min，90%甲醇)，流速為25 mL/min，上樣量為232 mg，檢測波長為300 nm。根據圖4 d，在5.9～7.1 min處手動收集第1個餾分，在8.7～10.0 min處手動收集第2個餾分，在14.6～16.3 min處手動收集第3個餾分，在26.6～28.0 min處手動收集第4個餾分。各個餾分經減壓濃縮除去溶劑，質量分別為25.1、11.3、16.5和19.8 mg。2.3化合物的純度檢測及結構鑒定經SP-HPLC分離純化收集得到的餾分經減壓濃縮后，用甲醇溶解，經HPLC檢測純度分別為98.7%、99.3%、98.4%和99.1%，相應的HPLC圖如圖5所示。

注：a.化合物1;b.化合物2；c.化合物3；d.化合物4。1. 山姜素；2. 松屬素； 3. 小豆蔻明；4. 榿木酮。Note:a. Compound 1; b. Compound 2; c. Compound 3; d. Compound 4. 1. Alpinetin; 2. Pinocembrin; 3. Cardamonin; 4. Alnustone. 圖5　4種化合物的HPLC圖Fig.5　HPLC chromatograms of four compounds

2.3.1化合物1。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:10.88 (1H,s,7-OH),7.54 (2H,m,H-2′,6′),7.33 (3H,m,H-3′,4′,5′),6.43 (1H,d,J=2.5 Hz,H-8)。 6.13 (1H,d,J=2.5 Hz,H-6),5.53 (1H,m,H-2),3.77 (3H,s,-OCH3),3.13 (1H,t,H-3α),2.85 (1H,m,H-3β)。13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:189.5 (C-4),166.3 (C-7),165.2 (C-5),163.2 (C-9),140.0 (C-1′),129.0 (C-3′,4′,5′),128.7 (C-2′,6′),104.7 (C-10),96.7 (C-6),94.5 (C-8),78.6 (C-2),55.6 (-OCH3),45.7 (C-3)。 以上數據和文獻[10]報道基本一致，故確定化合物1為山姜素。

2.3.2化合物2。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:12.10 (1H,s,5-OH),10.83 (1H,s,7-OH),7.50 (2H,m,H-2′,6′),7.32 (3H,m,3′,4′,5′),6.46 (1H,d,J=2.5 Hz,H-8),6.12 (1H,d,J=2.5 Hz,H-6),5.50 (1H,m,H-2),3.09 (1H,t,H-3α),2.76 (1H,m,H-3β)。13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:192.6 (C-4),166.3 (C-7),164.5 (C-5),163.2 (C-9),139.0 (C-1′),128.6 (C-3′,4′,5′),127.7 (C-2′,6′),102.7 (C-10),95.7 (C-6),94.5(C-8),78.6 (C-2),44.0 (C-3)。以上數據和文獻[11]報道基本一致，故確定化合物2為松屬素。

2.3.3化合物3。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 13.73 (1H,s,6-OH),10.76 (1H,s,4-OH),7.90 (1H,d,H-α),7.78(1H,d,H-β),7.65 (2H,m,H-2′,6′),7.43 (3H,m,H-3′,4′,5′),6.02 (1H,d,J=2.1 Hz,H-5),5.95 (1H,d,J=2.1 Hz,H-3),3.88 (3H,s,-OCH3)。13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:194.3 (C=O),169.0 (C-4),167.1 (C-6),165.0 (C-2),142.9 (C-β),137.3 (C-1′),131.4 (C-α),129.9 (C-2′,6′),129.5 (C-3′,4′,5′),107.1 (C-1),97.4 (C-3),92.7 (C-5),56.3 (-OCH3)。以上數據和文獻[12-13]報道基本一致，故確定化合物3為小豆蔻明。

2.3.4化合物4。1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:7.15～7.44 (11H,m,Ar-H and H-7),6.89 (1H,dd,J=8.2,12.5 Hz,H-6),6.83 (1H,dd,J=8.2,12.3 Hz,H-5),6.25 (1H,d,J=12.3 Hz,H-4),2.95 (2H,m,H-1),2.89 (2H,m,H-2)。13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ:199.0 (C-3),142.4 (C-5),141.0 (C-1′′),140.9 (C-7),135.7 (C-1′),129.2 (C-6),128.9 (C-4),128.5 (C-2′,6′),128.2 (C-3′,5′),128.0 (C-3′′,5′′),126.9 (C-4′′),126.3 (C-2′′,6′′),125.8 (C-4′),42.0 (C-2),29.9 (C-1)。以上數據和文獻[4]報道基本一致，故確定化合物4為榿木酮。

3　結論

該研究使用C18柱，甲醇-水為流動相，通過考察流動相的組成、流速及上樣量對分離效果的影響，優化了分離條件，建立了SP-HPLC分離純化草豆蔻中有效成分的方法。在優化的試驗條件下，一次分離可以得到4種高純度化合物，經UV和NMR鑒定分別為山姜素、松屬素、小豆蔻明和榿木酮。與傳統的分離純化方法相比，該法具有高效、快速、簡便的優點，適合于草豆蔻中主要有效成分的快速制備。

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Separation of Active Components inAlpiniakatsumadaiHayata by Semi-preparative High Performance Liquid Chromatography

WANG Yan-cui,LI Ai-feng,SUN Ai-ling,LIU Ren-min*

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Liaocheng University,Liaocheng,Shandong 252059)

[Objective] The aim was to develop a semi-preparative high performance liquid chromatography (SP-HPLC) method for separation and purification of four effective components fromAlpiniakatsumadaiHayata. [Method] Using C18column (250 mm×25.4 mm I.D.,10 μm),the optimum separation conditions were obtained through investigating the effects caused by the composition and flow rate of the mobile phase and the sample size. Elution was performed by preparative chromatography,product effluent was collected online according to detection signal,the purity of separated fraction was detected by HPLC method. [Result] The suitable conditions were listed as follows:the mobile phase was methanol-water in stepwise elution mode,the flow rate of the mobile phase was 25 mL/min,the sample size was 232 mg,and the detection wavelength was 300 nm. Under the above conditions,four compounds obtained purification through one-step separation. They were identified as alpinetin,pinocembrin,cardamonin and alnustone by ultraviolet spectrum (UV) and nuclear magnetic resonance (NMR) analysis,and the purities of the four compounds were 98.7%,99.3%,98.4% and 99.1% as determined by high performance liquid chromatography (HPLC). [Conclusion] Comparing with the traditional separation method,the SP-HPLC method developed in the paper has many advantages such as high efficiency,facility,and high speed. And it was suitable for rapid preparation of effective components fromA.katsumadai.

Semi-preparative high performance liquid chromatography;AlpiniakatsumadaiHayata; Active ingredient; Separation

山東省自然科學基金(ZR2014BQ023)。

王延翠(1988- )，女，山東新泰人，碩士研究生，研究方向：藥物分離與分析。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事分離科學研究。

2016-06-27

S 567

A

0517-6611(2016)24-127-04