11種保健酒中游離氨基酸的比較分析

李沁婭，孫寶國(guó)，鄭福平，黃明泉，孫金沅，孫嘯濤，李賀賀

（1.北京工商大學(xué)北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048； 2.北京工商大學(xué)北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048； 3.北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京100048）

11種保健酒中游離氨基酸的比較分析

李沁婭，孫寶國(guó)，鄭福平，黃明泉，孫金沅，孫嘯濤，李賀賀

（1.北京工商大學(xué)北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048； 2.北京工商大學(xué)北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048； 3.北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京100048）

通過(guò)使用氨基酸自動(dòng)分析儀，對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的11種保健酒中的游離氨基酸進(jìn)行了定性定量分析，研究結(jié)果顯示，11種保健酒中共檢測(cè)到25種氨基酸，包含6種人體必需氨基酸，另外，天冬酰胺、瓜氨酸、胱硫醚、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸、1-甲基組氨酸、乙醇胺、磷酸絲氨酸、鵝肌肽等是首次在保健酒中檢出，并對(duì)其進(jìn)行了定量分析；11種保健酒的總游離氨基酸質(zhì)量濃度范圍在32.17～1799.14 mg/L之間，其中，寧夏紅枸杞酒（1799.14 mg/L）和沱牌枸杞酒（1183.98 mg/L）的總游離氨基酸含量明顯多于其他保健酒；通過(guò)聚類分析，寧夏紅枸杞酒、沱牌枸杞酒與其他酒樣可以明顯區(qū)分開來(lái)。

氨基酸自動(dòng)分析； 保健酒； 游離氨基酸； 定量分析； 聚類分析

中國(guó)的保健酒，是指對(duì)人體具有保健功能的飲料酒，同時(shí)具備有3種屬性，即食品屬性、功能屬性和非藥品屬性［1］。不同保健酒的原料差別很大，其制作方法可分為浸提法、釀制法、配制法［2］。保健酒具有活血化瘀、抗炎癥、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等保健功能，截止2014年6月，獲得國(guó)家審批注冊(cè)的保健酒已有529種［3］，并還在持續(xù)增加。

目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)保健酒的研究，集中在利用各種食品和藥材，如富硒酵母蛋白［4］、多肽液［5］、食用菇［6］、烏毛蕨［7］、杜仲［8］、瑪咖［9］等所具有的保健功能，開發(fā)新的保健酒，通過(guò)優(yōu)化其工藝，并對(duì)保健功能和營(yíng)養(yǎng)成分的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行研究［10］，如抗氧化能力、多酚、黃酮、總糖、氨基酸、原料中特有功效成分等。如李昱鼎［11］利用竹子、茶和糯米，采用黃酒的工藝發(fā)酵制竹茶酒，優(yōu)化其發(fā)酵工藝，并研究了竹茶酒在體外、體內(nèi)的抗氧化活性；鄭向華［12］綜述了黑米酒中氨基酸、生物活性肽、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)和保健成分的研究，并介紹了幾種新型的黑米保健酒及其營(yíng)養(yǎng)保健功效。氨基酸含量不僅是保健食品的重要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)之一［13］，還與酒中的一些揮發(fā)性物質(zhì)的來(lái)源有一定關(guān)系［14］，也會(huì)影響酒精飲料的風(fēng)味［15］。早在1986年詹炳耀［16］發(fā)現(xiàn)，杜康酒中所測(cè)出的氨基酸含量都達(dá)不到相應(yīng)的味覺閾值，但補(bǔ)加勾兌品嘗試驗(yàn)表明，氨基酸對(duì)口味有明顯影響。我國(guó)國(guó)內(nèi)對(duì)保健酒中氨基酸的研究資料較少，多是對(duì)所配制研發(fā)的某種酒樣進(jìn)行分析［17］，對(duì)商品保健酒中的氨基酸分析的文獻(xiàn)較少［18］，且所分析的氨基酸種類在18種內(nèi)。

氨基酸自動(dòng)分析儀基于高效陽(yáng)離子交換樹脂柱分離及柱后茚三酮衍生法對(duì)氨基酸進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［19］。氨基酸分析儀通常分為蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)（鈉鹽系統(tǒng)）和生理體液系統(tǒng)（鋰鹽系統(tǒng)），利用不同濃度和pH值的檸檬酸鈉或檸檬酸鋰進(jìn)行梯度洗脫；鈉鹽系統(tǒng)一次最多分析約25種氨基酸，鋰鹽系統(tǒng)一次最多分析約50種氨基酸，可以更全面的反映氨基酸的信息［20］。本研究通過(guò)使用氨基酸自動(dòng)分析儀，首次采用生理體液系統(tǒng)較全面地分析了市售11種保健酒中游離氨基酸的類別及含量。本研究可為保健酒的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和保健功效提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

酒樣：均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻屑熬W(wǎng)上專賣店，并于4℃下保存。酒樣相關(guān)信息見表1。

試劑：5-磺基水楊酸（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；39種生理體液氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品：磷酸絲氨酸（Phser）、?；撬幔═aur）、磷酸乙醇胺（Pea）、尿素（Urea）、天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、肌氨酸（Sarc）、α-氨基己二酸（AAAA）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、瓜氨酸（Citr）、α-氨基丁酸（Aaba）、頡氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、胱硫醚（Cysth）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、β-丙氨酸（B-ala）、苯丙氨酸（Phe）、β-氨基異丁酸（Baiba）、高半胱氨酸（Homocys）、γ-氨基丁酸（Gaba）、乙醇胺（Ehan）、羥賴氨酸（Hylys）、鳥氨酸（Orn）、賴氨酸（Lys）、1-甲基組氨酸（1-Mhis）、組氨酸（His）、3-甲基組氨酸（3-Mhis）、鵝肌肽（Ans）、肌肽（Car）、精氨酸（Arg），美國(guó)SIGMA公司。

儀器設(shè)備：高速冷凍離心機(jī)（TGL-16gR），上海安亭科學(xué)儀器廠；氮?dú)獯蹈蓛x（BF-2000），北京八方世紀(jì)科技有限公司；Biochrom30+全自動(dòng)氨基酸分析儀，英國(guó)Biochrom公司；移液槍（100～1000μL），北京吉爾森科技有限公司；漩渦振蕩混勻器（Vortex Mixers-SA8），英國(guó)Stuart公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制及定量方法

所購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)品中磷酸絲氨酸、?；撬?、磷酸乙醇胺、尿素、乙醇胺、鵝肌肽、肌肽等不屬于氨基酸的物質(zhì)，方便起見，本文統(tǒng)一記為氨基酸。由于色氨酸容易分解，標(biāo)準(zhǔn)品混合液中不含色氨酸。

混合標(biāo)準(zhǔn)品中胱氨酸摩爾濃度為0.125 mmol/L，其他氨基酸摩爾濃度均為0.250 mmol/L。將混合標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成13個(gè)不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)液，其稀釋倍數(shù)為2倍、2.5倍、4倍、6倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、100倍、200倍、500倍。

將13個(gè)不同梯度氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣條件下進(jìn)樣，每個(gè)濃度重復(fù)3次，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后進(jìn)行樣品測(cè)試，樣品中檢測(cè)出的氨基酸通過(guò)保留時(shí)間進(jìn)行定性，最后根據(jù)樣品中所測(cè)氨基酸含量區(qū)間，選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制摩爾濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.2.2樣品前處理方法

搖勻酒樣，取3 mL保健酒樣品，加入3 mL 10%的5-磺基水楊酸，搖勻后于4℃冰箱中靜置22 h取出，以10000 r/min離心15 min后取1 mL上清液于進(jìn)樣瓶，40℃氮吹干后加入1 mL的pH2.2緩沖液，漩渦振蕩混勻，過(guò)0.22μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)酒樣2瓶，各取樣2次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3檢測(cè)條件

色譜柱：Biochrom Li型陽(yáng)離子交換樹脂柱，4.6 mm× 20 cm；柱溫：31～75℃；緩沖液流速：20 mL/h；茚三酮流速：20 mL/h；檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm、440 nm；分析時(shí)間125 min，進(jìn)樣量80μL。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

對(duì)11種市售保健酒中所測(cè)氨基酸含量用SPSS 20.0采用Ward法-平方Euclidean距離進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，并繪出樹狀圖，見圖3。

表1　保健酒樣品信息

圖1　39種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的分離圖譜

2　結(jié)果與分析

2.139種游離氨基酸分離圖譜及線性回歸方程建立

39種生理體液氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的分離圖譜見圖1，樣品分離見圖2。除羥脯氨酸和脯氨酸在440 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)外，其余37種氨基酸均在570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。

圖2　勁酒樣品的分離圖譜

由圖1和圖2可知，氨基酸分離效果較好，基線干擾少。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，11種保健酒共定性出25種氨基酸，其余14種氨基酸有的沒有檢測(cè)到，有的被雜峰影響無(wú)法定性定量。所測(cè)到的25種游離氨基酸的線性回歸方程見表2。由表2可知，除乙醇胺的線性系數(shù)為0.9867外，其余氨基酸的線性系數(shù)在0.9918～0.9996之間，方程線性關(guān)系良好。

2.2定量結(jié)果分析

保健酒酒樣中25種游離氨基酸的定量結(jié)果見表3，表中氨基酸含量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，其中磷酸絲氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸、胱硫醚、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、乙醇胺、鳥氨酸、1-甲基組氨酸、鵝肌肽這10種氨基酸是首次對(duì)其在保健酒中的含量進(jìn)行定量。

由表3可知，11種不同保健酒中總游離氨基酸的含量差別較大，總游離氨基酸質(zhì)量濃度范圍在32.17～1799.14 mg/L；酒樣H（寧夏紅枸杞酒，1799.14 mg/L）和酒樣B（沱牌枸杞酒，1183.98 mg/L）的總游離氨基酸含量最高，酒樣A（中國(guó)勁酒）以463.09 mg/L的含量排名第3，其他酒樣所測(cè)得氨基酸含量均小于200 mg/L；酒樣I（茵陳酒，32.17 mg/L）、酒樣D（陽(yáng)春牌酒，40.17 mg/L）和酒樣K（五加皮酒，55.09 mg/L）中含量較少。在所測(cè)酒樣中，酒樣A（中國(guó)勁酒）中檢測(cè)到特有成分鵝肌肽（6.88 mg/L），酒樣B（沱牌枸杞酒）中檢測(cè)到特有成分胱氨酸（2.94 mg/L），酒樣E（人參酒）中檢測(cè)到特有成分瓜氨酸（1.70 mg/L），酒樣F（至寶特質(zhì)三鞭酒）中檢測(cè)到特有成分天冬酰胺（9.47 mg/L）。

表2　保健酒樣中所含游離氨基酸的線性回歸方程

表3　保健酒樣中游離氨基酸的定量結(jié)果

在所測(cè)出的25種氨基酸中，有6種人體必需氨基酸，即纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸，11種保健酒中人體必需氨基酸的總量占總氨基酸的比例不同，在4.67%～19.18%之間；所測(cè)酒樣中所含游離必需氨基酸的質(zhì)量濃度范圍在5.74～95.73 mg/L，酒樣B（沱牌枸杞酒，95.73 mg/L）中含量最多，其次是酒樣H（寧夏紅枸杞酒，83.98 mg/L）、酒樣A（中國(guó)勁酒，28.38 mg/L）、酒樣C（椰島海王酒，13.06 mg/L），酒樣D（陽(yáng)春牌酒，5.74 mg/L）中含量最少。

通過(guò)對(duì)各酒樣中所測(cè)出的游離氨基酸含量從大到小排列，將累計(jì)總和達(dá)到80%的氨基酸定義為主要氨基酸，見表4。從表3和表4可以看出，精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸在酒樣A、B、D、G、H、K中為含量較高的5種游離氨基酸，酒樣E中最主要的游離氨基酸為精氨酸。通過(guò)比較本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張莊英［21］等所測(cè)大量白酒樣品中游離氨基酸含量可知，整體看來(lái)保健酒中的游離氨基酸含量比白酒多，其原因與保健酒中所用原料相關(guān)，即保健酒原料中的氨基酸會(huì)溶解在酒中。

表4　各保健酒樣中主要的游離氨基酸

根據(jù)所測(cè)每種保健酒中各氨基酸的含量，對(duì)11種保健酒進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。從樹形圖可以看出，11種保健酒分為2大類：第1類為酒樣B（沱牌枸杞酒）和酒樣H（寧夏紅枸杞酒），這兩種枸杞酒與其他保健酒有比較明顯的差別；第2類分的層次較多，酒樣A（中國(guó)勁酒）與酒樣C、D、E、F、G、I、J、K可以區(qū)分開，酒樣E又可與酒樣C、D、F、G、I、J、K再次區(qū)分，可能是由于酒樣E中精氨酸的比例明顯大于其他酒樣。酒樣C、D、G、I、J、K聚為一類，雖然氨基酸含量有差異，但聚類沒有將其明顯區(qū)分開來(lái)。聚類結(jié)果產(chǎn)生的原因可能與各種保健酒的原料及生產(chǎn)工藝有很大關(guān)系。

圖3　11種保健酒中氨基酸的聚類分析圖

綜上所述，保健酒中較高含量的游離氨基酸，不僅包括人體必需的氨基酸，還含有一些功能性氨基酸，這些氨基酸對(duì)人體都有重要的生理保健功能。必需氨基酸有甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等，甲硫氨酸參與膽堿的合成，具有去脂、防治動(dòng)脈硬化高血脂癥的功能，可以提高肌肉活力并促進(jìn)合成皮膚蛋白質(zhì)和胰島素；苯丙氨酸在機(jī)體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?，促進(jìn)合成甲狀腺素和腎上腺素；亮氨酸可以促進(jìn)傷口及骨頭愈合，缺乏亮氨酸會(huì)導(dǎo)致機(jī)體停止生長(zhǎng)，體重減輕［22］。除必需氨基酸外，其他氨基酸也會(huì)影響人體的氮平衡及相關(guān)生理功能，如γ-氨基丁酸是功能性氨基酸，是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種代謝活動(dòng)，具有降血壓、改善腦功能、增強(qiáng)記憶、抗焦慮及提高肝腎機(jī)能等生理作用［23-24］；甘氨酸、脯氨酸參與膠原形成及細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，有助于傷口愈合［25］；精氨酸有抗氧化、調(diào)節(jié)激素分泌和基因表達(dá)、增強(qiáng)免疫力的作用［26］，并與精子的數(shù)量和活動(dòng)力有關(guān)；絲氨酸參與合成半胱氨酸、嘌呤、嘧啶、神經(jīng)酰胺、磷脂酰絲氨酸及蛋白質(zhì)磷酸化［25］。

3　結(jié)論

通過(guò)使用氨基酸自動(dòng)分析儀，對(duì)11種保健酒中所含游離氨基酸做了定性定量分析，檢測(cè)出25種游離氨基酸，其中天冬酰胺、瓜氨酸、胱硫醚、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸、1-甲基組氨酸、乙醇胺、磷酸絲氨酸、鵝肌肽等是首次在保健酒中檢出。11種保健酒測(cè)得的總游離氨基酸質(zhì)量濃度范圍在32.17～1799.14 mg/L，不同保健酒中氨基酸含量差別較大。通過(guò)聚類分析，發(fā)現(xiàn)沱牌枸杞酒和寧夏紅枸杞酒與其他酒可以明顯區(qū)分開來(lái)，可能與這2種保健酒枸杞原料比例較大、氨基酸含量較高有關(guān)。

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Comparative Analysis of Free Amino Acids in 11 Kinds of Healthcare Wine

LI Qinya，SUN Baoguo，ZHENG Fuping，HUANG Mingquan，SUN Jinyuan，SUN Xiaotao and LI Hehe
（1.BeijingAdvanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048；2.Beijing Key Lab of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048；3.Beijing Lab for Food Quality and Safety，Beijing 100048，China）

In this study，free amino acids in 11 kinds of healthcare wine in domestic market were determined quantitatively and qualitatively by using automatic amino acid analyzer.The results suggested that，25 kinds of amino acids in total were detected in 11 kinds of healthcare wine including 6 necessary amino acids；In addition，asparagine，citrulline，cystathionine，β-alanine，γ-aminobutyric acid，ornithine，1-methyl histidine，ethanolamine，phosphoserine and anserine were detected and quantified for the first time in healthcare wine；total free amino acid concentration in 11 kinds of healthcare wine ranged between 32.17 mg/L and 1799.14 mg/L，among them，total free amino acid contents in Ningxiahong wolfberry wine（1799.14 mg/L）and in Tuopai wolfberry wine（1183.98 mg/L）were significantly higher than other healthcare wine. Through cluster analysis，it was found that Tuopai wolfberry wine and Ningxiahong wolfberry wine could be clearly distinguished from other healthcare wine products.

automatic amino acid analysis；healthcare wine；free amino acid；quantification；cluster analysis

TS262.91；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2016）09-0038-05

10.13746/j.njkj.2016147

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31471665和31301466）；北京市教委科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（KZ20140011015）。

2016-04-28

李沁婭（1992-），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榉治鰴z測(cè)，E-mail：liqinya1634051@163.com。

黃明泉（1977-），男，副教授，主要從事食品風(fēng)味研究，E-mail：hmqsir@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-07-11；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160711.1345.009.html。