采用響應面法優化高濃度發酵探究

王秋峰，杜風光，劉　鉞，喬建援，李　勇，王方方，劉　燕

（河南天冠企業集團有限公司，車用生物燃料技術國家重點實驗室，河南南陽473000）

采用響應面法優化高濃度發酵探究

王秋峰，杜風光，劉鉞，喬建援，李勇，王方方，劉燕

（河南天冠企業集團有限公司，車用生物燃料技術國家重點實驗室，河南南陽473000）

高濃度發酵在當下酒精發酵行業是勢在必行。實現高濃度發酵，在采用高效酵母的同時，控制主發酵期的溫度是很必要的。發酵溫度由34℃降低為32.5℃，酒精度將達到16%vol以上，總糖維持在生產要求的2.5%左右，通過響應面法對高濃度發酵的條件進行優化，為生產提供參考和依據。

高濃度發酵； 響應面法； 發酵溫控； 酒精

隨著國家減少碳排量目標的制定，而汽車保有量的不斷增加，燃料乙醇工業緩解了石油資源短缺的問題，減輕了對進口石油的依賴程度［1］。燃料乙醇是大勢所趨，但是我國的酒精發酵行業卻面臨如下問題：如原料供應問題，按照規劃，到2020年我國的燃料乙醇目標為1500 萬t，而對應的糧食消耗為4200萬t，需要采用非糧作物如木薯、糖類和纖維質等［2-3］生產酒精。經過幾十年的發展，我國酒精廠的發酵醪酒精含量與國外還是有一定的差距，提高酒精發酵罐的發酵能力，降低能耗、水耗，降低成本，最有效的途徑就是采用提高酒精濃度即濃醪發酵［5］。雖然濃醪發酵技術有許多好處，但是應用過程還有許多問題需要解決，首先高濃度發酵需要耐高濃度、耐高溫以及耐高酒度的優良菌株，其次要提高生產管控水平，對發酵過程溫度過高能夠及時有效地調節和管控。否則盲目提高濃度可能釀成生產事故。

本實驗以天冠集團與浙江大學合作選育的耐高酒精度、耐高溫與耐高濃度菌株作為菌種，結合生產車間原料為發酵醪，應用降低開發成本、優化實驗條件、提高生產效率、有效的響應面優化法［6-9］對工藝進行優化，為生產提供參考和依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

菌種：天冠集團實驗中心高轉項目組實驗室保藏。實驗原料：木薯粉、玉米粉、A/B淀粉漿，燃料乙醇生產車間。

實驗試劑：神舟糖化酶，酶活力100000 U/mL；諾維信液化酶，酶活力70000 U/mL；隆大酸性蛋白酶，酶活力50000 U/mL；尿素。

儀器設備：電熱恒溫水浴鍋，DK-S28，上海精宏實驗設備有限公司；電熱恒溫培養箱，DHP-2010，華利達實驗儀器公司；恒溫培養振蕩器，ZHWY-211C，上海智城分析儀器制造有限公司；萬用電爐，DL-1北京中興偉業儀器有限公司。

1.2實驗方法

工藝流程：混合原料分組液化后再混合→稀釋一定量液化醪接菌種制作酒母→向成熟酵母中添加液化醪并且同步糖化發酵→蒸餾。

實驗過程盡量模擬生產過程進行。采用混合原料發酵（玉米、小麥、木薯），分組液化可以提高物料的利用率以及降低能耗，即將玉米與水按比例混合后，添加高溫液化酶以95～100℃液化2～3 h，木薯粉與小麥淀粉漿（小麥通過洗濾后制成的淀粉漿）混合后，添加高溫液化酶以90～95℃液化，冷卻后按一定比例混合。在實驗室三角瓶搖床發酵，采用三角瓶中直接培養酒母，待培養成熟后（細胞數1億/mL，出芽率20%以上）向三角瓶中添加液化醪糖化酶進行同步糖化發酵。

1.3分析方法

酒精度的測定、總酸的分析、外觀糖的測定、殘還原糖的測定、殘總糖的測定按文獻［10］方法進行。

1.4高濃度發酵的單因素實驗

1.4.1發酵濃度對酒精發酵的影響

將液化醪稀釋至物料濃度為25%，裝入1000 mL三角瓶中接種發酵菌落培養，培養成熟后，分別添加不同濃度的液化醪，使總發酵濃度分別為270 g/L、290 g/L、310 g/L，在32℃培養箱中搖動發酵，轉速為100 r/min，直至發酵結束（失重小于0.2 g/h），檢測其酒精度。重復3次，取其平均值。

1.4.2發酵溫度對酒精發酵的影響

將液化醪稀釋至物料濃度為25%，裝入1000 mL三角瓶中接種發酵菌落培養，培養成熟后，分別添加不同濃度的液化醪使總發酵濃度為290 g/L，分別在30℃、32℃、34℃溫度下發酵，培養箱中搖動發酵，轉速為100 r/min，直至發酵結束（失重小于0.2 g/h），檢測其酒精度。重復3次，取其平均值。

1.4.3發酵時間對酒精發酵的影響

將液化醪稀釋至物料濃度為25%，裝入1000 mL三角瓶中接種發酵菌落培養，培養成熟后，分別添加不同濃度的液化醪使總發酵濃度為290 g/L，發酵溫度為32℃，培養箱中搖動發酵，轉速為100 r/min，分別在60 h、66 h 和72 h檢測其酒精度。重復3次，取其平均值。

1.5高濃度酒精發酵的響應面設計

在單因素實驗基礎上，采用Box-Behnken模型選取發酵濃度、發酵溫度以及發酵時間作為響應面法的考察因素。以酒精度作為響應值，用統計學軟件Design-Expert 8.0設計3因素3水平響應面分析實驗，各因素的編碼與取值見表1。

表1　響應面編碼與取值情況

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果

2.1.1發酵濃度對酒精發酵的影響（圖1）

由圖1可知，32℃時隨著濃度的升高，酒精產量不斷增加，當濃度達到290 g/L后，酒精含量升高不顯著，而且隨著濃度升高，酒精產率反而降低，原因是酵母受到過高的糖濃度脅迫使發酵無法進行。

2.1.2發酵溫度對濃醪酒精發酵的影響（圖2）

圖1　不同濃度原料發酵結果的影響

圖2　不同溫度對濃醪酒精發酵的影響

由圖2可知，發酵濃度為290 g/L，在28℃下發酵很緩慢，在64 h后發酵酒精度不高，隨著溫度升高，發酵速率加快，在一定時間內物料得到更充分利用，但是隨著發酵溫度的升高，產酒精率不斷下降，是由于濃醪發酵勢必產生高濃度的酒精，高溫造成酒精對酵母的損害作用，而溫度的升高加劇了該損害作用使酵母大量死亡，發酵無法進行。

2.1.3發酵時間對濃醪發酵的影響（圖3）

圖3　不同發酵時間對濃醪發酵的影響

由圖3可知，在發酵濃度為290 g/L、發酵溫度為32℃，發酵到72 h時，隨著發酵時間進行而酒精度不斷上升，72 h后，隨著時間延長，生酸污染的風險增大而且延長時間不利于提高設備利用率。

2.2響應面實驗結果（表2）

2.3回歸模型的建立（表3）

通過統計軟件Design-Expert 8.0以酒精度為響應值，對表2進行多元回歸擬合，得出參數的初步回歸模型：

表2　響應面設計與結果

剔除不顯著項，經過優化后回歸模型為：

表3　酒精度回歸模型方差分析

由表3可知，模型P值為0.0015表明回歸模型方程極顯著：失擬項0.4579＞0.05，表明不顯著，模型的校正決定系數為RADJ=0.9330，表明回歸模型與實測數值可以較好的擬合。變異系數（CV）表示實驗的精確度，值越大，實驗結果的可靠度越低，實驗CV為1.67%在可接受范圍，表明此模型可以對酒精度結果進行分析和預測。

回歸方程各變量系數顯著性檢驗可知，模型（1）的一次項中A-溫度、B-濃度影響極為顯著，C-時間影響不顯著，交互項都不顯著，二次項A2影響顯著。

2.4酒精發酵工藝優化以及驗證

通過Design-Expert軟件設計對高濃度發酵的溫度控制進行優化，設計的最適濃度為310 g/L，發酵溫度為30.70℃，發酵時間為68.3 h，預測酒度為16.44%vol，考慮到實際的生產控制情況，以及設備利用率，在進行3組平行驗證實驗時將溫度調高到32.5℃，發酵濃度290 g/L，發酵時間64 h，發酵結果為酒度15.8%vol，比軟件預測的15.55%vol提高了1.6%vol，在國內屬于先進水平，可以將此發酵工藝設為最佳生產參數。

3　結論

高濃度發酵的前提條件是選育耐高酒、耐高溫與耐高濃度菌株作為菌種，天冠企業集團通過與浙江大學合作選育優良菌株［11］并且與生產緊密結合，使該企業的發酵酒度與原料利用率得到比較大的提高。

由于發酵溫度對微生物生命活動影響很大，發酵結果的好壞與溫控有密切關系，所以在進行高濃度發酵時一定要做好溫控工作，可以選擇溫度較低的季節或者加大板冷以及打循環的強度。

通過Design-Expert軟件設計對高濃度發酵的溫度控制進行優化，設計的最適濃度為310 g/L，發酵溫度為30.70℃，發酵時間為68.3 h，預測酒度為16.44%vol，在考慮到實際的生產控制情況，將溫度調高到32.5℃，發酵濃度為290 g/L，發酵時間為64 h，發酵結果為酒度15.8%vol，比軟件預測的15.55%vol還提高了1.6%vol，結合實際的生產工藝管控以及管理水平，可以適當降低發酵溫度同時調高發酵濃度，充分利用資源做到提高生產率、提高原料利用率、節能增效才是企業發展之道。

［1］王成軍.燃料乙醇在美國和巴西的發展［J］.國際石油經濟，2005，13（5）：51.

［2］陶榮，白曉峰，蔣磊.未來可持續發展的新動力——秸稈發酵制酒精［J］.釀酒，2006，33（3）：45-49.

［3］馬曉健，趙銀峰，祝春進，等.以纖維素類物質為原料發酵生產燃料乙醇的研究進展［J］.食品與發酵工業，2004（11）：77-81.

［4］方亞葉.酒精廢糟液的綜合處理［J］.釀酒，2003，30（1）：74-79.

［5］黃宇彤.酒精濃醪發酵菌種選育及發酵條件的優化［D］.天津：天津科技大學，2002.

［6］陸燕，梅樂和，陸悅飛，等.響應面法優化工程菌產細胞色素P450 BM-3的發酵條件［J］.化工學報，2006（5）：1187-1192.

［7］ 蔣丹丹，張彬，梁志宏，等.響應面法優化降膽固醇馬紅球菌F21-1的發酵培養基［J］.中國農業大學學報，2008（2）：20-24.

［8］郝學財，余曉斌，劉志鈺，等.響應面方法在優化微生物培養基中的應用［J］.食品研究與開發，2006（1）：38-41.

［9］ 江元翔，高淑紅，陳長華.響應面設計法優化腺苷發酵培養基［J］.華東理工大學學報（自然科學版），2005（3）：309-313.

［10］王福榮.釀酒分析與檢測［M］.北京：化學工業出版社，2005：230-270.

［11］張曉陽，杜風光，池小琴，等.代謝工程與全基因組重組構建釀酒酵母抗逆高產乙醇菌株［J］.中國生物工程雜志，2011（7）：91-97.

Optimization of High-Concentration Fermentation by Response Surface Method

WANG Qiufeng，DU Fengguang，LIU Yue，QIAO Jianyuan，LI Yong，WANG Fangfang and LIU Yan
（State Key Lab of Motor Vehicle Biofuel Technology，He'nan Tianguan Enterprise Group Co.Ltd.，Nanyang，He'nan 473000，China）

High-concentration fermentation is imperative in alcohol fermentation industry at present.Except for the use of high-efficiency yeast，it is necessary to control the temperature during chief fermentation period.In the experiment，as fermentation temperature dropped from 34℃to 32.5℃，alcohol content would reach above 16%vol with total sugar content at around 2.5%，which met the requirements of the production.The optimization of high-concentration fermentation by response surface method provided reference for practical production.

high-concentration fermentation；response surface method；temperature control；alcohol

TS262.2；TS261.4

A

1001-9286（2016）09-0086-03

10.13746/j.njkj.2016170

2016-05-19

王秋峰（1983-），碩士研究生，工程師，研究方向：生物能源研究。