超聲輔助提取辣椒籽蛋白工藝優化

李 茉，倪元穎，彭 郁，溫 馨，王宇曉

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超聲輔助提取辣椒籽蛋白工藝優化

李 茉，倪元穎※，彭 郁，溫 馨，王宇曉

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

以辣椒籽為原料，采用超聲輔助法提取辣椒籽蛋白并利用響應面優化法提取工藝，在單因素試驗的基礎上，選取pH值，提取時間，超聲功率，料液比4個因素進行響應面試驗，根據所得試驗結果確定最佳提取條件為：pH值11，提取時間13.31 min，超聲功率336.21 W，料液比1∶35.85，在此條件下蛋白的預計提取量為5.90 g/(100 g)。利用Design expert軟件對影響辣椒籽蛋白提取量的主要因素及其相互作用進行探討，結果由大到小依次為：pH值>料液比>提取時間>超聲功率。與傳統提取方法相比，超聲輔助法使得蛋白提取量增加了0.81 g/(100 g)（占傳統方法提取量的15.46%），蛋白純度提高了5.47%。

蛋白；超聲波；提取；辣椒籽；響應面設計

0 引 言

辣椒籽是一種豐富的營養資源，含有蛋白質、油脂、粗纖維、維生素和礦物質等營養物質[1]。要了解或應用辣椒籽蛋白質的理化性質和功能性質，最基本的一步是將蛋白質從這種復雜的機體混合物中分離出來，因此辣椒籽蛋白提取工藝是深加工研究的基礎。

堿提酸沉法是最傳統的提取方法，應用最廣泛，這種方法的優勢在于成本低，操作簡單，但它的缺點是提取時間長，提取率低[2-4]。所以近些年來，利用一些輔助方法可以縮短提取時間并且可以提高蛋白的提取率，其中最為常用的方法就是超聲輔助法。

超聲輔助提取法利用超聲波產生強烈振動、強烈的空化效應和攪拌作用來破壞植物細胞，結合溶劑浸提法達到提取的目的。高能量的超聲波作用可以使液體破裂成很多小空穴，這些小空穴閉合時產生的瞬時壓力高達幾千個大氣壓，在輔助提取過程中，能夠有效地破壞原料細胞壁或者包埋結構的外層，使細胞內容物釋放，加速有效成分進入溶劑，增加有效成分的提取率[5-8]。

植物蛋白因其資源豐富、廉價易得以及其獨特的生理功能而備受關注，目前已有大量文獻報道了多種植物源蛋白質較動物蛋白具有低膽固醇和低脂肪的營養特性[9-10]，同時還具有良好的功能性質，可用作天然的新型食品添加劑[11-15]，此外一些植物蛋白經過改性或酶解后，可獲得具有抑菌，抗氧化，降血壓等生物活性的多肽，這些多肽除了用作天然食品防腐劑或抗氧化劑外，還可成為開發保健品或藥品的新資源[16-19]。

目前對辣椒籽中蛋白的提取工藝研究很少。有文獻對辣椒籽蛋白組分進行了分析，研究了12個辣椒品種的籽蛋白，發現清蛋白或谷蛋白的含量最高[20]。因此，本文采用超聲輔助堿提酸沉法對辣椒籽中的蛋白質進行提取分離，先通過單因素試驗比較不同條件下的提取效果，再結合響應面設計試驗，優選出辣椒籽蛋白的最佳提取時間，超聲波功率，料液比及提取液pH值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆甜椒籽（L，由新疆晨光公司提供，打粉過40目篩后在-18 ℃冰箱冷藏備用。正己烷、氫氧化鈉、濃鹽酸、氯化鈉、乙醇均購置于國藥集團化學試劑有限公司，考馬斯亮藍G-250、PBS緩沖液、BSA標準品均購置于北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 試驗儀器

T6型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；IKA C-MAGHS7型磁力攪拌器：梅特勒-托利多公司；WD-9405B型水平搖床：北京六一儀器廠；TGL-16C型高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；KQ-500DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LGJ-12型冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司；FE20-K型pH計：梅特勒-托利多公司；WKX型高速粉碎機：青州市精誠機械有限公司；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 辣椒籽脫脂處理

用高速粉碎機將除雜后的辣椒籽粉碎，過篩40目，然后室溫下用正己烷1:5（g/mL）料液比浸泡，置于搖床上脫脂3 h，真空抽濾，收集殘渣再重復進行脫脂，共3次，最后置于通風櫥過夜，得到脫脂辣椒籽粉，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 脫脂辣椒籽粉中基本成分分析

蛋白質含量測定方法參照GB 5009.5-2010[21]，采用凱氏定氮法測定；脂肪含量的測定方法參照GB/T 5009.6-2003[22]的方法，將樣品置于索式提取器中，用石油醚來提取脂肪；灰分含量測定參照GB 5009.4-2010[23]的方法，將樣品置于（550±25）℃下煅燒4 h，稱量殘渣的質量；水分含量的測定參照GB 5009.3-2010[24]的方法，將樣品在（105±1）℃的烘箱中干燥至恒重。碳水化合物含量的測定參照Zhu等[25]的方法，按100%減去樣品的水分含量，灰分含量，脂肪含量及蛋白質含量的總和。

1.3.3 辣椒籽蛋白組分及含量分析

參考Osborne[26]關于植物蛋白4種蛋白的分離方法，首先稱取2.000 g樣品，以去離子水為溶劑，料液比1:15（g/mL），室溫下磁力攪拌30 min，然后10 000×，4 ℃離心15 min，過濾后留上清液，為了充分提取蛋白，提取和離心過程重復3次，然后合并上清液，所得蛋白為清蛋白。接下來殘渣依次用1 mol/L NaCl溶液，70%乙醇溶液和0.1 mol/L NaOH溶液以相同的提取方法提取，獲得的蛋白分別為球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。收集的上清液蛋白含量采用Bradford測定，計算每種蛋白占總蛋白提取量比例。

1.3.4 超聲輔助法辣椒籽蛋白的提取

采用超聲輔助堿溶酸沉的方法對辣椒籽中的蛋白進行提取，因為影響提取效果的因素較多，為確定最佳提取工藝，選取超聲功率、提取時間、料液比、溶液pH值為考察指標，先進行單因素試驗確定蛋白提取過程中各因素的變化規律。

1.3.5 可溶性蛋白濃度測定

采用Bradford法進行蛋白濃度測定。用牛血清蛋白作為標準物進行測定，精確吸取0、100、200、300、400、500L，不足500L補加0.05 mol/L PBS（pH值 6.80）至終體積500L，同時吸取稀釋后的待測樣品500L，再加5 mL考馬斯亮藍溶液混合均勻，靜置3 min，用紫外可見分光光度計在595 nm下測定吸光值。測標準蛋白和樣品吸光值時，以蛋白質濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標作圖。以BSA標準品作為標準蛋白，繪制標準曲線。根據標準曲線計算樣品中蛋白質的濃度，再以此來確定樣品的蛋白提取量，單位為g/(100 g)。

1.3.6 單因素試驗

1）pH值對辣椒籽蛋白提取效果的影響

準確稱取1.000 g左右的脫脂辣椒籽粉，記下質量。用0.5 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L HCl溶液調節提取液的pH值為7、8、9、10、11，料液比（g/mL）為1∶20，在（30±3）℃下超聲20 min，超聲功率為400 W，然后室溫下4 200×離心20 min，收集上清液，按照前文1.3.4所述方法測定提取液中的可溶性蛋白含量。

2）提取時間對辣椒籽蛋白提取效果的影響

準確稱取1.000 g左右的脫脂辣椒籽粉，記下質量。加入去離子水，料液比（g/mL）為1∶20，用0.5 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L HCl溶液調節提取液的pH值為9，在（30±3）℃下超聲功率為400 W，超聲時間分別設為5、10、15、20、25、30 min，然后室溫下4 200×離心20 min，收集上清液，按照前文1.3.4所述方法測定提取液中的蛋白含量。

3）超聲功率對辣椒籽蛋白提取效果的影響

準確稱取1.000 g左右的脫脂辣椒籽粉，記下質量。加入去離子水，料液比（g/mL）為1∶20，用0.5 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L HCl溶液調節提取液的pH值為9，在（30±3）℃下超聲時間為20 min，超聲功率分別設為200、300、350、400、500 W，然后室溫下4 200×離心20 min，收集上清液，按照前文1.3.4所述方法測定提取液中的蛋白含量。

4）料液比對辣椒籽蛋白提取效果的影響

準確稱取1.000 g左右的脫脂辣椒籽粉，記下質量。加入去離子水，料液比（g/mL）分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，用0.5 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L HCl溶液調節提取液的pH值為9，在（30±3）℃下超聲功率為400 W，超聲時間20 min，然后室溫下4 200×離心20 min，收集上清液，按照前文1.3.4所述方法測定提取液中的蛋白含量。

1.3.7 響應面法設計試驗

采用Design Expert 8.0.6軟件，以蛋白質提取量為響應值，采用中心組合試驗Box-Behnken Design（BBD）[27]，選定pH值，提取時間，提取功率，料液比為自變量進行四因素三水平試驗設計并對結果進行分析。試驗設計編碼值如表1所示。

表1 響應面四因素三水平響應面試驗設計

1.3.8 超聲輔助提取法與傳統堿溶酸沉法比較

稱取1.000 g脫脂辣椒籽粉，在響應面優化出的最佳pH值，提取時間，料液比，40 ℃的條件磁力攪拌，然后室溫下4 200×離心20 min，收集上清液，按照前文1.3.4所述方法測定提取液中的蛋白含量。所得結果為傳統堿溶酸沉的蛋白提取量，與超聲輔助法提取辣椒籽蛋白的結果進行比較。然后調節溶液pH值為4使蛋白沉降，離心去上清液，用適量稀堿液中和，將分離出來的蛋白凝膠破解，再凍干制得蛋白粉，測蛋白粉中的蛋白含量。

2 結果與分析

2.1 脫脂辣椒籽粉中基本成分分析

經測定脫脂前新疆甜椒籽脂肪質量分數為18.3%，脫脂后的新疆甜椒籽粉主要成分如表2所示，可以發現辣椒籽粉脂肪質量分數明顯降低，僅有1.76 %，蛋白質總質量分數為20.5 g/(100 g)。

表2 脫脂新疆甜椒籽的主要成分

2.2 辣椒籽蛋白組分及含量分析

按照Osborns分離植物蛋白的方法發現本實驗選用的辣椒籽蛋白4種蛋白組分所占比例如表3所示，蛋白質量分數由高到低排序依次為清蛋白44.90%，谷蛋白31.78%，球蛋白22.36%，醇溶蛋白0.95%。由此可以看出，清蛋白和谷蛋白是辣椒籽蛋白的主要組成，總質量分數超過75%；質量分數最少的蛋白為醇溶蛋白。這與胡志輝等[20]研究的12個辣椒品種的辣椒籽內四種蛋白組成結果一致，他們發現蛋白以清蛋白和谷蛋白質量分數最高，清蛋白為種子干質量的1.79%～19.07%，谷蛋白為種子干質量的2.40%～19.03%，其次是球蛋白，質量分數為2.10%～8.13%，醇溶蛋白質量分數最低，為1.57%～3.03%。

表3 新疆甜椒籽蛋白組分及質量分數比較

注：表中數值用平均值±標準差表示。

Note: Values in the table were expressed in average value ± standard deviation.

2.3 單因素試驗

2.3.1 pH值對辣椒籽蛋白提取效果的影響

如圖1所示，辣椒籽蛋白的提取量隨著pH值的增加而增大，在pH值為11時達到最大。因為在高pH值條件下有利于氫鍵斷開，氫離子脫離碳原子或硫酸鹽基團，使蛋白質表面電荷數增加[28]，促進了蛋白質與蛋白質間的靜電排斥和水合作用使蛋白質更易溶解。但天然植物蛋白常與酚類物質以各種方式結合，過高的pH值可能會促進酚類物質的褐變而影響蛋白產物的色澤[29]。毛曉英[2]和Venkatachalam等[30]研究核桃蛋白提取得到相似結果，在pH值11以后，核桃蛋白的提取率提高不顯著（>0.05），且提取液顏色發生褐變[30]。因此本試驗沒有選擇pH值≥12的嚴苛條件，避免出現嚴重的美拉德反應和蛋白質變性。試驗顯示在pH值為11時蛋白提取量最大。

此外，本研究通過對辣椒籽蛋白乳化性，起泡性及吸水吸油性等功能性質進行檢測，判斷在此條件下蛋白是否變性。試驗結果顯示辣椒籽蛋白與大豆油的乳液平均粒徑為5.49m，呈正態分布，說明辣椒籽蛋白可形成較穩定的乳液，具有較好的乳化性質；辣椒籽蛋白溶液的起泡性為2.3，雖低于大豆蛋白溶液（3.3），但仍高于葡萄籽蛋白（0.25）[11]；辣椒籽蛋白的吸油性為（5.63±0.30）g/g高于大豆蛋白（2.43 g/g），吸水性為（2.66±0.06）g/g，與豌豆分離蛋白的吸水性（2.57～2.88 g/g）和草豌豆的吸水性（2.63～3.11）g/g[31]接近。上述結果說明在pH值11的條件下辣椒籽蛋白仍具有較好的功能性質，它在食品加工中應用的潛力有待進一步的系統研究。

2.3.2 提取時間對辣椒籽蛋白提取效果的影響

如圖2所示，當提取時間≤15 min時，蛋白提取量隨著時間增加而顯著升高（<0.05）；當提取時間從15 min增大到30 min時，提取量沒有顯著變化（>0.05）。在提取初期，辣椒籽蛋白沒有充分溶解，隨著提取時間增加，脫脂粉中蛋白不斷溶出，當提取時間為15 min左右時，在固定條件下，大部分蛋白已經溶出，因此隨后即使再增加時間，提取液中蛋白含量的變化沒有顯著性差異（>0.05）。

2.3.3 超聲功率對辣椒籽蛋白提取效果的影響

如圖3所示，隨超聲功率的增加，辣椒籽蛋白提取量也隨之增大，當功率達到400 W時，提取量最高，但隨后當超聲功率增大到最大功率500 W時，蛋白提取量反而略有下降，這可能是在超聲功率低于400 W時，隨著功率增大，空化作用和機械作用越強烈，分子擴散速度也越大，溶劑更容易滲透到辣椒籽內部，蛋白質分子滲出越快，溶出量越大[32]。功率超過一定范圍時，超聲頻率過高，會產生大量的無用的汽泡，增加衍射衰減，形成聲屏障，不利于空化現象的產生[33]。

2.3.4 料液比對辣椒籽蛋白提取效果的影響

如圖4所示，在開始階段隨著料液比的增大，辣椒籽蛋白提取量也顯著增大（<0.05），當料液比達到1∶30后，蛋白提取量開始出現下降趨勢，且變化趨于和緩。這是因為當料液比達到一定程度時，分子擴散速度趨于一定，溶液稀釋作用也對蛋白質的溶解增加作用不顯著，蛋白質分子與蛋白質分子之間的吸附作用可能大于蛋白質分子與水之間的擴散作用，從而導致蛋白質溶出量略有下降[7]，此外料液比過大也不利于節約資源。

2.4 響應面優化法

2.4.1 Box-Behnken試驗設計與結果

以辣椒籽蛋白提取量為響應值進行響應面優化的試驗結果如表4所示，采用Design Expert軟件，選擇Box-Behnken Design模型，對試驗設計中各組的蛋白提取量進行回歸分析，得到回歸方程如下：

=5.24+0.511+0.0622+0.0283+0.324?0.1212?0.05513?0.03214?0.04523?0.1224+0.0134+0.04512?0.1822?0.03232?0.2842

式中為辣椒籽蛋白提取量，g/(100 g)；1，2，3，4分別為pH值，提取時間，超聲功率，料液比4個自變量的編碼值。響應值中蛋白提取量與回歸方程預測值的相關系數為0.974 8，擬合狀況良好，說明建立的回歸模型可行。

表4 響應面分析試驗設計及結果

2.4.2回歸方程顯著性分析

為檢查回歸方程的有效性，進一步確定相關因素對辣椒籽蛋白提取量的影響程度，對回歸模型進行方差分析，結果如表5。

經分析發現，該模型的值為38.73，<0.000 1，說明所選模型極為顯著，失擬項=0.289 3>0.05，說明失擬項差異不顯著；由自變量的值可知，模型一次項1、4，二次項42差異極顯著（<0.0001），二次項22，交互項12，24顯著（<0.05），其他項差異不顯著。由自變量值大小可知，各因素對辣椒籽蛋白提取量的影響由大到小依次為：pH值>料液比>提取時間﹥超聲功率。

表5 回歸方程模型系數的顯著性檢驗

2.4.3 反應條件優化及模型驗證

利用Design Expert軟件優化試驗數據，得出超聲輔助堿溶酸沉法提取蛋白的最佳工藝參數為：pH值11，提取時間為13.31 min，超聲功率336.21 W，料液比1∶35.85，在此條件下蛋白的預計提取量為5.90 g/(100 g)。為了檢驗上述優化結果，本試驗利用優化后的試驗參數進行驗證試驗。考慮到實際的可行性和便利性，修正提取工藝為：pH值11，提取時間為13 min，超聲功率350 W，料液比1∶36，在此條件下做3次平行試驗蛋白的提取量為(6.05±0.09) g/(100 g)，略高于Design Expert軟件預測值。說明采用響應面法優化得到的辣椒籽蛋白提取條件準確可靠，具有實用價值。

2.5 超聲輔助提取法與傳統堿溶酸沉法比較

超聲輔助提取法和傳統堿溶酸沉法辣椒籽蛋白的提取量分別為（6.05±0.07）和（5.24±0.05）g/(100 g)，蛋白純度分別為83.93%和78.46%，可以發現超聲輔助法使得蛋白提取量增加了0.81 g/(100 g)（占傳統方法提取量的15.46%），蛋白純度提高了5.47%，還提高了辣椒籽蛋白粗提物的純度5.47%。這是因為超聲波可以產生強烈振動、空化效應和攪拌作用來破壞植物細胞，使細胞內的蛋白更易溶出，提高了蛋白產率。

3 結 論

本文采用超聲輔助法提取辣椒籽蛋白，利用響應面法對提取工藝進行優化，應用Design-Expert8.0.6軟件，采用Box-Behnken建立了pH值，提取時間，超聲功率，料液比與辣椒籽蛋白提取量的數學模型，決定系數2=0.9748，回歸模型顯著，擬合程度好，有實際意義。

通過單因素和響應面試驗確定最佳提取條件為：pH值11，提取時間為13.31 min，超聲功率336.21 W，料液比1∶35.85。與傳統溶劑法提取辣椒籽蛋白相比，超聲波輔助法提取量和蛋白純度較高。此外通過顯著性試驗得到，影響提取量的主要因素由大到小依次為：pH值>料液比>提取時間>超聲功率。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction of capsicum seed protein isolate

Li Mo, Ni Yuanying※, Peng Yu, Wen Xin, Wang Yuxiao

(100083,)

Capsicum seed protein isolate is a new type of plant protein resources. From this research, the protein isolate was separated into water-soluble(WS), salt-soluble(SS), alkaline-soluble(AS) and ethanol-soluble(ES) fractions. Water-soluble and ethanol-soluble fractions were the major constituents, about more than 75% of the total protein. This paper focused on ultrasonic-assisted extraction technology of extracting protein isolate from capsicum seed. Response surface methodology was used to determine optimum conditions for protein extraction. The experiments designed 29 groups of different conditions to extract protein from capsicum defatted flours. Independent variables which would affect protein extracting rate were discussed, such as pH (7, 8, 9, 10 and 11), ultrasonic power (200, 300, 350, 400 and 500 W), extraction time (10, 15, 20, 25 and 30 min) and material-solvent ratio (1:10, 1:20, 1:30, 1:40 and 1:50). The model equation was set up. In the model equation, the coefficient of association (2) was 0.9748, indicating it’s a reasonable matching to the experimental data. The optimized conditions were as follows: pH value was 11, ultrasonic power was 336.21 W, extraction time was 13.31 min and the material-solvent ratio was 1:35.58. According to this optimized condition, the extraction rate of protein isolate was 5.90 g/(100 g) defatted red pepper seed. Due to the limitations of experimental facilities, the optimized conditions were modified. The results were as follows: pH value was 11, ultrasonic power was 350 W, extraction time was 13 min and the material-solvent ratio was 1:36. The optimum conditions were verification. The results showed that extraction at the modified conditions gave a protein yield at 6.05 g/(100 g). The experimental values were found to be in agreement with the predicted ones. Analysis of variance (ANOVA) of independent variables was performed. The statistical analysis data revealed that linear, quadratic and interaction terms was significant (<0.05). The lack of fit test measured the failure of the model to represent data in experimental domain at points which are not included in the regression. There was a non-significant lack of fit that further validates the model (> 0.05).The significance of each coefficient was determined using thetest andvalue. pH value and solvent/meal ratio were the most significant factors (<0.001). Also, interaction effect of pH and extraction time, interaction effect of extraction time and materials/solvent ratio were both significant (<0.05). The ultrasonic power was not significant factor (>0.05). The main factors were analyzed by Design software, which could affect the yield of protein. The results were as follows: pH value>material/solvent ratio>extraction time>ultrasonic power. Compared with traditional extraction methods, the extraction yield of protein increased from 5.24 to 6.05 g/(100g), while the purity of capsicum seed protein isolate enhanced from 78.46% to 83.93% by ultrasonic-assisted method. These results give the advices in processing protein from capsicum seeds according to optimized condition. Furthermore, it provides a theoretical reference for the industrial production and application of capsicum seed protein isolate.

protein; ultrasonic; extraction; capsicum seed; response surface methodology

10.11975/j.issn.1002-6819.2016.24.042

TS255.36

A

1002-6819(2016)-24-0309-06

2016-07-02

2016-11-20

國家公益性行業專項園藝作物產品加工副產物綜合利用（201503142）

李茉，博士生，主要從事天然產物提取研究，北京 中國農業大學食品科學與營養工程學院，100083。Email：limo_0125@163.com.

倪元穎，教授，博士生導師，主要從事果蔬加工研究，北京 中國農業大學食品科學與營養工程學院，100083。Email：niyuany@163.com