3種消毒劑對金黃色葡萄球菌殺菌作用的研究

蘇潤雨，聶伯堯，楊百亮

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3種消毒劑對金黃色葡萄球菌殺菌作用的研究

蘇潤雨，聶伯堯，楊百亮通信作者

（天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300384）

為了解來蘇兒、百毒殺、84消毒液對金黃色葡萄球菌的抑制作用，本試驗通過采集膿汁并分離鑒定出金黃色葡萄球菌，采用抑菌試驗和懸液定量殺滅試驗對來蘇兒、百毒殺、84消毒液殺滅金黃色葡萄球菌的效果進行觀察。結果顯示：84消毒液和百毒殺作用于金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑明顯大于來蘇兒，且5～20 min內能快速高效殺滅金黃色葡萄球菌，來蘇兒的殺滅率較低。來蘇兒對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，百毒殺和84消毒液對金黃色葡萄球菌有很好的殺滅作用，84消毒液優于百毒殺。

消毒劑；金黃色葡萄球菌；殺滅作用

金黃色葡萄球菌（）簡稱金黃色葡萄球菌，為革蘭氏陽性無芽孢球菌，廣泛分布于空氣、水、土壤、飼料、人和動物體表及與外界相通的腔道，常引起人和動物組織器官膿腫、創傷化膿以致敗血癥、膿毒敗血癥以及食物中毒等，也可引起葡萄球菌病，其臨床表現為消瘦、精神沉郁，伴有腹瀉，一年四季均可發生，尤以氣候溫暖和潮濕季節多發，屬于人獸共患病原菌[1]。金黃色葡萄球菌引起的皮膚化膿感染和手術部位的化膿性感染目前在寵物行業越來越多見，因此采用有效的消毒劑來對病原體進行消滅，對其傳播途徑進行切斷，控制疾病的蔓延，保護易感種群顯得十分必要。

近年來，消毒劑在細菌污染方面的廣泛應用得到了高度重視，但消毒劑的種類多，作用原理大不相同，來蘇兒是含50%煤酚的肥皂溶液，又稱為煤酚皂，其主要殺菌成分為甲酚，屬于酚類消毒劑，其消毒原理是使蛋白質變性、沉淀，使酶系統失活，能抑制和殺死部分細菌的繁殖體和親酯病毒，屬于低效消毒劑[2]。百毒殺屬雙鏈季銨鹽類消毒劑，其主要成分為10%葵甲溴銨溶液，主要是通過改變細胞膜的通透性，使細胞質外漏進而殺滅細菌等微生物[3]。84消毒劑屬鹵素類消毒劑，其殺菌機理是氧化菌體中的活性基團，與氨基結合使蛋白質變性。選擇細菌敏感性高的消毒劑在防控動物疫病方面至關重要。

本試驗通過杯碟法和懸液定量殺滅法研究來蘇兒、百毒殺、84消毒劑對金黃色葡萄球菌的抑制作用，選用合適的消毒劑來快速消滅金黃色葡萄球菌，以較好地控制化膿性感染和葡萄球菌病。

1 材料

1.1 病料

本試驗無菌采取天津農學院附屬動物醫院一患膿皮病白色泰迪幼犬背部化膿處的膿汁，置 4 ℃冰箱待檢。

1.2 消毒劑與中和劑

來蘇兒、百毒殺、84消毒液分別配制5種濃度：2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%，并做好標記，硫代硫酸鈉中和劑、吐溫-80中和劑[4]均由天津農學院預防獸醫學實驗室提供。

1.3 試驗器材與試劑

超凈工作臺、恒溫恒濕培養箱、高壓滅菌鍋、恒溫培養振蕩器、電子天平、電子顯微鏡，冰箱、電爐子、牛津杯、游標卡尺及常用玻璃器材由天津農學院預防獸醫學實驗室提供；營養瓊脂粉、氯化鈉、蛋白胨、牛肉膏、蒸餾水、3%過氧化氫溶液等由天津農學院預防獸醫學實驗室提供；葡萄球菌屬細菌生化鑒定管購于杭州天和微生物試劑有限公司；羊血瓊脂培養基購于天津金章科技公司。

2 方法

2.1 培養基的制備

營養瓊脂培養基制備：營養瓊脂 42 g，加入 1 000 mL純化水加熱煮沸溶解，并高壓滅菌備用。倒板時需在超凈工作臺中進行。

7.5%氯化鈉肉湯制備：蛋白胨10 g，牛肉膏 5 g，氯化鈉75 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.4，加熱溶解，調節pH值，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min[5]。

普通液體培養基制備：牛肉膏3～5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，加熱溶解，調節pH7.4～7.6，過濾分裝，121 ℃高壓滅菌15 min。

2.2 細菌的分離培養與純化

無菌采取膿汁，并與生理鹽水按1:10比例混合，接種于7.5%氯化鈉肉湯中并放在37 ℃恒溫箱進行增菌培養18～24 h[6]，取出并觀察細菌的生長狀況。然后劃線接種于營養瓊脂和羊血瓊脂培養基上，倒置37 ℃恒溫箱中培養18～24 h，取出并觀察細菌的菌落特征。然后挑取可疑單個菌落于羊血瓊脂上進行純化培養，并觀察菌落特征，放置4 ℃冰箱備用。

2.3 鏡檢

用滅菌接種環挑取有溶血現象的單個菌落于潔凈的載玻片上，并與少量適當生理鹽水混勻，均勻地涂布成適當大小的薄層[7]。待自然干燥后將其固定，然后做革蘭染色，在顯微鏡下鏡檢觀察細菌的形態。

2.4 菌懸液的制備

將分離出的單個菌落接種到普通液體培養基中，放到37 ℃恒溫培養振蕩器中培養24 h，觀察培養基的渾濁度，根據其渾濁度再培養12 h，制備成均勻的菌懸液[8]。然后拿出培養基置于4 ℃冰箱備用。

2.5 觸酶試驗

取潔凈載玻片1張，用接種環挑取單個菌落于載玻片上，然后滴加一滴3%H2O2，立即觀察結果[9]。

2.6 生化試驗

將細菌純化后，取典型的單個菌落分別接種于乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、木膠糖、尿素、蕈糖、N-乙酰葡糖胺、硝酸鹽生化管，37 ℃培養24 h[10]。

2.7 抑菌試驗

采用杯碟法，取0.1 mL菌懸液于營養瓊脂培養基上，涂布均勻，然后再輕輕的放5個無菌牛津杯，要求分散且等距[11]。在牛津杯中分別加入 5種濃度梯度且等量的消毒劑，做好標記。放入37 ℃恒溫箱中培養24 h，取出，觀察比較抑菌圈大小，測出并記錄各抑菌圈的直徑[12]。該試驗重復3次，取平均值。

2.8 懸液定量殺滅試驗

該工藝能夠將油層近井地帶的散砂、污染物和雜質排出地面，解決了出砂油藏油井生產管理中存在的砂埋油層、井筒砂堵、井下及地面設備磨蝕、砂卡等突出矛盾，簡化了出砂油田的采油工藝，延長了油井生產周期，降低了油井的維護費用；同時利用加溫后的地層水作動力液，循環過程中提高了地層溫度，對稠油起到降黏功效的同時增加了近井地帶油層滲透率，從而大幅度提高了油井的產能。

首先，10倍倍比稀釋菌懸液并涂板計數，作為消毒前菌數。然后取菌懸液50 μL分別加入450 μL不同濃度的消毒劑，混勻，分別作用5 min及20 min后，取出100 μL加到900 μL中和劑中（84消毒液的中和劑為硫代硫酸鈉，來蘇、百毒殺的中和劑為吐溫-80），此時溶液共1 000 μL，再從這1 000 μL中取50 μL混合液加入450 μL滅菌蒸餾水，取樣液并稀釋涂板，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，進行活菌計數，作為消毒后菌數，并計算殺滅率[13]。

3 結果

3.1 菌落形態與形態學檢查

營養瓊脂培養基上生長良好，形成濕潤、表面光滑、邊緣整齊、不透明、隆起的金黃色圓形菌落（圖1A）；羊血瓊脂培養基上形成的菌落較大，菌落周圍出現溶血環（圖1B）。細菌在普通液體培養基和7.5%氯化鈉肉湯中37 ℃培養24 h后，均勻渾濁，管底有少量沉淀，搖動易散；在油鏡下，可見革蘭氏染色為陽性，成對、短鏈或成串（葡萄狀）排列，無芽孢莢膜。由此可初步判斷其為金黃色葡萄球菌。

（注：A. 普通培養基上生長的菌落；B. 羊血瓊脂培養基上生長的菌落）

3.2 觸酶試驗結果

大多數需氧和兼性厭氧菌均產生過氧化氫酶，但鏈球菌科為陰性。本試驗過程中產生大量氣泡，為陽性結果，可進一步確定此菌為金黃色葡萄球菌。

3.3 生化試驗結果

細菌生化鑒定結果見表1。該菌能分解乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、尿素等物質，產酸不產氣，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，與葡萄球菌生化特性相符。

表1 生化試驗結果

注：＋表示呈陽性

3.4 抑菌試驗結果

由圖2和表2可知，百毒殺和84消毒液對金黃色葡萄球菌有很好的抑制作用，經杯碟法試驗可見，兩種消毒劑在5個濃度梯度上均有明顯的抑菌圈，且84消毒液的抑制作用較強。2.0%以上濃度的來蘇兒對金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，1.5%以下濃度的來蘇兒對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，0.5%濃度的來蘇兒對金黃色葡萄球菌幾乎沒有抑制作用。相同條件下，金黃色葡萄球菌對3種消毒劑的敏感性均隨濃度的升高而升高。

（注：A. 來蘇兒處理組；B. 百毒殺處理組；C. 84消毒液處理組）

表2 不同濃度的消毒劑抑菌圈直徑大小 cm

3.5 懸液定量殺滅試驗結果

如表3所示，各濃度84消毒液與金黃色葡萄球菌作用5 min對其殺滅率即為100%；各濃度百毒殺與金黃色葡萄球菌作用20 min對其殺滅率為100%，但作用5 min時，1.5%以上濃度的百毒殺對其殺滅率才達到100%，可見84消毒液對金黃色葡萄球菌的殺滅效果優于百毒殺。來蘇兒對金黃色葡萄球菌的殺滅作用較弱，2.0%以下濃度的來蘇兒對金黃色葡萄球菌的殺滅率均較低，2.5%濃度的來蘇兒對金黃色葡萄球菌有一定殺滅作用。綜上所述，在相同的時間下，隨著濃度的增加，各種消毒劑對金黃色葡萄球菌的殺滅作用均逐步增強，84消毒液的殺滅作用最好，其次為百毒殺，來蘇兒的殺滅作用最弱。

表3 消毒劑對金黃色葡萄球菌的殺滅率

4 討論

4.1 分離鑒定

本次試驗分離菌在羊血瓊脂培養基上生長的菌落較大，且有完全溶血現象，這與金黃色葡萄球菌的菌落生長特征相同。普通培養基上形成濕潤、表面光滑、邊緣整齊、不透明、隆起的圓形菌落與金黃色葡萄球菌的生長特性相符。鏡檢結果可知，菌體堆積成葡萄串狀排列、無芽孢、無莢膜的革蘭氏陽性菌落，結合以上結果可初步確定此菌為葡萄球菌。生化試驗結果全為陽性，進一步說明此菌為金黃色葡萄球菌。因金黃色葡萄球菌與鏈球菌的生長特性及顯微鏡下細菌的形態相似，不好區分，但鏈球菌不具有過氧化氫酶，所以采用觸酶試驗，其結果顯示為陽性，即該菌具有過氧化氫酶活性，可立即分解過氧化氫，產生氣泡，因此進一步確定此菌為金黃色葡萄球菌。

4.2 殺滅效果比較

本文通過杯碟法抑菌試驗和懸液定量殺滅試驗，比較研究了實驗室常用的3種消毒劑對金黃色葡萄球菌的抑菌作用。結果顯示，時間、溫度、消毒劑濃度相同的條件下，84消毒液和百毒殺作用的金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑明顯大于來蘇兒處理組的抑菌圈直徑，說明來蘇兒的抑菌作用最弱。溫度、時間、消毒劑濃度相同的條件下，84消毒劑對金黃色葡萄球菌的殺滅率高于百毒殺和來蘇兒，來蘇兒的殺滅率最低，與上述抑菌試驗的結果吻合。綜上所述，在相同試驗條件下，84消毒液、百毒殺、來蘇兒對金黃色葡萄球菌的殺滅效果依次降低，表明金黃色葡萄球菌對84消毒液、百毒殺的敏感性較高。其中百毒殺為季銨鹽類消毒劑，有研究認為復合季銨鹽類消毒劑對革蘭氏陽性的敏感性較高，與本試驗結論一致[9]。另外，3種消毒劑的殺菌效果均隨作用時間的延長 而增強，與作用濃度也成正相關，這與其他相關的研究報道結果也類似[8]。

此外，由于目前抗生素濫用現象嚴重，一些常見病原菌的耐藥性不斷提高，給臨床應用帶來了嚴峻挑戰。例如，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是最常見的多重耐藥菌，國內外屢有暴發流行的報道，已成為世界范圍內醫療費用快速增長和導致患者死亡率升高的主要因素，成為當前醫院感染控制的難點[14]。有研究報道顯示，來蘇兒對金黃色葡萄球菌臨床菌株的抑菌作用明顯弱于對標準菌株的抑制效果[11]。因此，本研究建議將這兩種消毒劑交替使用，以避免金黃色葡萄球菌對其產生耐藥性，造成巨大經濟損失。

5 結論

試驗表明，84消毒劑和百毒殺對金黃色葡萄球菌有很強的抑菌效果，來蘇兒的抑菌效果相對較差，84消毒劑和百毒殺作為殺滅金黃色葡萄球菌的高效消毒劑，建議臨床使用。

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Study on Killing Effect of Three Disinfectants against

SU Run-yu, NIE Bo-yao, YANG Bai-liangCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

To study the effects of Lysol, didecyl dimethyl ammonium bromide solution and 84 disinfectant in killing. Bacteriostatic test and suspension quantitative killing test were conducted in the laboratory, respectively. Larger inhibition zone were observed onagar media which were treated with 84 disinfectant and didecyl dimethyl ammonium bromide solution, andcould be killed by them quickly and effectively in 5~20 min. It is suggested that the sterile efficacy of Lysol is weaker significantly than other two disinfectants onAmong of these disinfectants, 84 disinfectant is the best choice in killing pathogenic bacteria clinically.

disinfectants;; killing effect

P641.131；S152.72

A

1008-5394（2016）03-0051-04

2016-01-05

天津市自然科學基金項目“豬傳染性胃腸炎病毒單克隆抗體免疫生物制劑研制”（033608511）

蘇潤雨（1990-），女，河北唐山人，碩士在讀，研究方向為預防獸醫學。E-mail：1558761240@qq.com。

楊百亮（1960-），男，山西洪洞人，教授，碩士，主要從事預防獸醫學研究。E-mail：bailiangyang@163.com。