四妙丸中鹽酸小檗堿和蒼術素的含量測定方法研究

王艷秋 劉向前

摘要[目的]建立四妙丸中鹽酸小檗堿和蒼術素的含量測定方法。[方法]采用高效液相色譜法，色譜柱為Promosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）～0.1% H3PO4溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序為：0～5 min，25%A；5～7 min，25%～90% A；7～15 min，90%A；檢測波長340 nm。[結果]鹽酸小檗堿和蒼術素的線性范圍分別為0.25～2.50和0.32～3.20 μg，平均回收率分別為97.5%和96.8%，RSD分別為2.6%和2.8%。[結論]該方法準確、可靠，可作為四妙丸的質量控制方法。

關鍵詞 四妙丸；鹽酸小檗堿；蒼術素；含量測定

中圖分類號 R284.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）09-157-03

Abstract[Objective]To establish a method for the content determination of berberine hydrochloride and atractylodin in Simiao pills.[Method]The HPLC method was adopted with Promosil C18 chromatography column（250 mm×4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was acetonitrile （A）-0.1% H3PO4 solution （B） with gradient eluent， the elution program was 0-5 min， 25% A； 5-7 min， 25%-90% A； 7-15 min， 90% A. The detection wavelength was 340 nm.[Result]The linear ranges of berberine hydrochloride and atractylodin were 0.25-2.5 and 0.32-3.2 μg， respectively. The average recovery rates of the two components in Simiao pills were 97.5% and 96.8%， while RSD were 2.6% and 2.8%， respectively.[Conclusion]The method is accurate and reliable for the quality control of Simiao pills.

Key words Simiao pill； Berberine hydrochloride； Atractylodin； Content determination

四妙丸由蒼術、鹽黃柏、牛膝、薏苡仁四味中藥組成，是在二妙丸基礎上加味牛膝以及薏苡仁而來，方中黃柏作為君藥，行使清熱燥濕之功；蒼術輔助以燥濕健脾之效，為臣藥；牛膝的功效為補益肝腎、強化筋骨、活血兼舒絡，并可引藥下行，作為輔藥，同時行使佐使藥之功；薏仁健脾祛濕、利水消腫，為佐藥；諸藥相輔相成，標本皆可兼治[1]。四妙丸是治療下焦濕熱、足膝紅腫熱痛之良方，經過歷代醫家的臨床實踐及推演，再加上當代醫學藥理學的試驗研究，其應用范圍已經更加廣泛，是許多濕熱體質患者的首選方劑[2-4]。

方中君藥黃柏中的主要成分為鹽酸小檗堿，臣藥蒼術的主要有效成分為蒼術素，測定二妙丸、三妙丸、四妙丸中鹽酸小檗堿含量的方法最常用的是高效液相色譜法[5-6]，用毛細管氣相色譜測定這3種復方中蒼術素含量[7]。該研究采用高效液相色譜法同時測定四妙丸中鹽酸小檗堿和蒼術素的含量，為四妙丸的質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1100 series HPLC儀（真空脫氣機、柱溫箱、四元泵、VWD）（美國安捷倫公司）；UV3010型紫外分光光度儀（日本日立公司）；CP225D型十萬分之一分析天平（德國SARTORIUS公司）。

1.2 試材

四妙丸為自制，藥材均采購于安徽亳州藥材市場，由遼寧中醫藥大學中藥鑒定教研室李峰教授進行鑒定，各藥材均符合藥典規定；對照品鹽酸小檗堿（中國藥品生物制品檢定所，批號110713-200911）、蒼術素（上海中藥標準化研究中心，批號17-2001）；乙腈、甲醇為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 測定波長的選擇。分別取蒼術素、鹽酸小檗堿對照品溶液，在200～400 nm進行掃描，鹽酸小檗堿的最大吸收波長為265和349 nm，蒼術素在340 nm處有較大吸收，因此選擇340 nm為檢測波長。

1.3.2 色譜條件。Promosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）～0.1%H3PO4溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序為：0～5 min，25%A；5～7 min，25%～90%A；7～15 min，90%A；流速1.0 mL/min；檢測波長340 nm；柱溫為室溫；進樣量20 μL。

1.3.3 供試品溶液制備方法考察。按四妙丸處方比例取黃柏、蒼術、薏苡仁、牛膝四味藥材，粉碎過40目篩，備用。

1.3.3.1 提取方法的考察。按處方比例，分別精密稱取藥材粉末3份，每份1 g，置于50 mL圓底燒瓶中，加入甲醇30 mL，稱重。分別考察加熱回流2 h、超聲提取30 min、索氏提取4 h這3種提取方式的提取效果，提取后放冷，并用甲醇補足重量，混合均勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液20 μL注入高效液相色譜儀，測定，分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術素峰面積，計算其含量。

1.3.3.2 提取溶媒的考察。按處方比例，精密稱取藥材粉末4份，每份1 g，置50 mL圓底燒瓶中，分別精密加入30 mL甲醇、95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇，加熱回流2 h，提取后放冷，用相應的提取溶媒補足重量，混勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液20 μL注入高效液相色譜儀，測定，分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術素峰面積，計算其含量。

1.3.3.3 溶媒用量的考察。精密稱取藥材粉末3份，每份1 g，置250 mL圓底燒瓶中，分別精密加入75%乙醇50、100、150 mL，稱重，加熱回流2 h，提取后放冷，用溶媒補足重量，混勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液20 μL注入高效液相色譜儀，測定，分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術素峰面積，計算其含量。

1.3.3.4 提取時間的考察。精密稱取藥材粉末3份，每份1 g，置250 mL圓底燒瓶中，精密加入75%乙醇100 mL，稱重，分別加熱回流0.5、1.0、2.0 h，提取后放冷，用溶媒補足重量，混勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液20 μL注入高效液相色譜儀，測定，分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術素峰面積，計算其含量。

1.3.4 對照品溶液的制備。精密稱取鹽酸小檗堿和蒼術素標準品適量，用甲醇分別配制成濃度為1.00和0.64 mg/mL的對照品儲備液，精密吸取鹽酸小檗堿對照品儲備液12.5 mL、蒼術素對照品儲備液25 mL，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得對照品混合溶液（鹽酸小檗堿濃度250 μg/mL，蒼術素濃度320 μg/mL），避光保存。精密量取鹽酸小檗堿和蒼術素混合對照品儲備液，分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，作為混合系列對照品溶液。

1.3.5 陰性樣品溶液的制備。按照藥典所載處方比例，分別制備無黃柏、蒼術的陰性樣品，按“1.3.3”方法制備陰性樣品溶液。

1.3.6 方法學考察。

1.3.6.1 系統適應性試驗。取樣品溶液、混合對照品溶液和陰性對照溶液，按“1.3.2”色譜條件測定，繪制HPLC圖譜[10]，考察系統適應性。

1.3.6.2 線性關系考察。取“1.3.4”系列混合對照品溶液，其中鹽酸小檗堿濃度分別為12.50、25.00、50.00、75.00、100.00、125.00 μg/mL，蒼術素濃度分別為16.00、32.00、64.00、96.00、128.00、160.00 μg/mL，分別精密吸取上述混合對照品溶液各20 μL，進樣，按“1.3.2”色譜條件分析，以峰面積為縱坐標、進樣量為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.6.3 精密度試驗。精密吸取中間濃度（鹽酸小檗堿濃度75.00 μg/mL，蒼術素含量96.00 μg/mL）混合對照品溶液20 μL，按照“1.3.2”色譜條件測定，重復進樣6次，分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術素的峰面積。

1.3.6.4 穩定性試驗。精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，通過HPLC分析并分別記錄鹽酸小檗堿和蒼術素的峰面積，計算RSD值。

1.3.6.5 重復性試驗。取同一批樣品共6份，每份1 g，精密稱定，其余按“1.3.3”方法制備供試品溶液，進樣，測定，計算鹽酸小檗堿和蒼術素的含量和RSD。

1.3.6.6 加樣回收率試驗。取已知含量（鹽酸小檗堿6.26 mg/gL、蒼術素5.31 mg/g）的樣品6份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入鹽酸小檗堿對照品溶液4 mL（濃度為1.00 mg/mL）和蒼術素對照品溶液4 mL（濃度為0.64 mg/mL），按“1.3.3”制備供試品溶液并測定，計算樣品的回收率和RSD。

1.3.7 樣品的含量測定。按“1.3.1”～“1.3.6.1”方法測定3個批次四妙丸中鹽酸小檗堿和蒼術素的含量。

2 結果與分析

2.1 供試品溶液制備方法

2.1.1 提取方法的考察。從表1可以看出，采用加熱回流提取法進行提取得到的2種成分含量較高，故該試驗供試品的制備方法確定為加熱回流提取法。

2.1.2 提取溶媒的考察。從表2可以看出，采用甲醇提取蒼術素和鹽酸小檗堿含量最高，但液相圖譜中干擾色譜峰較多，而75%乙醇提取二者含量與甲醇提取相似，且干擾較少，故選擇75%乙醇為提取溶媒。

2.1.3 溶媒用量的考察。從表3可以看出，加溶媒量100和150 mL的這2種成分含量明顯高于加入50 mL，而加入100 mL與加入150 mL溶媒的二者含量變化不大，故選擇加入100 mL的75%乙醇提取。

2.1.4 提取時間的考察。由表4可見，提取1 h樣品已經基本提取完全，增加時間二者含量變化不明顯，故選擇加熱回流時間為1 h。

綜上所述，確定供試品溶液的制備方法為：取四妙丸粉末1.0 g，精密稱定，加75%乙醇100 mL，加熱回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得，避光保存。

2.2 方法學考察。

2.2.1 系統適應性試驗。圖1表明，蒼術素和鹽酸小檗堿

色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均符合要求，說明蒼術素和鹽酸小檗堿與其他組分完全分離，陰性樣品溶液在鹽酸小檗堿與蒼術素的峰位置處無干擾。

2.2.2 線性關系考察。按“1.3.6.2”方法操作，以峰面積為縱坐標、進樣量為橫坐標繪制標準曲線，得出蒼術素和鹽酸小檗堿的回歸方程分別為y=3.857× 104x-1.273×104（r=0.999 9）、y=1.763 66×105x-2.719 73×105（r=0.999 3），說明鹽酸小檗堿、蒼術素分別在0.25～2.50、0.32～3.20 μg范圍內線性關系良好。

2.2.3 精密度試驗。按“1.3.6.3”方法操作，計算得出鹽酸小檗堿和蒼術素的峰面積的RSD均小于3.0%，符合有關規定，表明在此試驗條件下精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗。按“1.3.6.4”方法操作，計算得出鹽酸小檗堿和蒼術素的峰面積的RSD值均小于3.0%，符合有關規定，表明鹽酸小檗堿和蒼術素在24 h內比較穩定。

2.2.5 重復性試驗。按“1.3.6.5”方法操作，計算得鹽酸小檗堿和蒼術素的含量的平均值分別為6.26和5.31 mg/g，二者的RSD均小于3.0%，表明該方法重現性良好。

2.2.6 加樣回收試驗。按“1.3.6.6”方法操作，計算鹽酸小檗堿和蒼術素的平均回收率分別為97.5%和96.8%，RSD分別為2.6%和2.8%，符合有關規定。表明該方法準確、可靠，可用于四妙丸中鹽酸小檗堿和蒼術素的含量測定。

2.3 含量測定

由表5可知，不同批號四妙丸中鹽酸小檗堿含量接近，蒼術素的含量也差別不大。

3 討論和結論

（1）四妙丸為二妙丸類方，以往文獻關于方中蒼術的含量測定多以茅術醇和β桉葉油醇為對照品，該研究采用2010版《中國藥典》中蒼術項下收載的對照品蒼術素作為指標性成分建立含量測定方法，這為更好地控制四妙丸的質量提供了基礎[8]。

（2）試驗中流動相的選擇曾嘗試用甲醇-磷酸系統、乙腈-甲酸系統等，經反復摸索最終確定乙腈～0.1% H3PO4溶液梯度洗脫，并確定了最佳洗脫程序。

（3）蒼術素為聚乙烯炔類成分，對光不穩定，試驗過程中供試品和對照品溶液均應放在棕色瓶中避光保存[9]。

（4）該研究采用高效液相色譜法同時測定四妙丸中鹽酸小檗堿和蒼術素的含量，結果表明，鹽酸小檗堿和蒼術素的線性范圍分別為0.25～2.50和0.32～3.20 μg，平均回收率分別為97.5%和96.8%，RSD分別為2.6%和2.8%。該方法準確、可靠，可作為四妙丸的質量控制方法。

參考文獻

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