一種從動物源性化妝品中快速提取DNA的方法研究

梁水美 范陽陽 劉艷艷 卞如如 朱天翼 張全芳 步迅

摘要：為了達到從分子水平上檢測化妝品動物源性成分的目的，本研究建立了一種從化妝品中提取動物源性基因組DNA的方法。該方法使用Chelex-100結合玻璃奶提取化妝品中的基因組DNA，具有污染小、操作簡單、快速、高效等優點。分別利用紫外分光光度計、普通PCR和DNA測序等方法對提取DNA的質量進行檢測，結果表明DNA濃度和純度均能達到后期分子檢測要求。說明本方法提取的DNA適用于在分子水平上檢測化妝品的動物源性成分。

關鍵詞：化妝品；動物源性；基因組DNA；提取方法

中圖分類號：S188文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）09-0131-05

AbstractIn order to achieve the purpose of detecting animal origin of cosmetics at the molecular level， a method for extracting genomic DNA of animal origin from cosmetics was established. The Chelex-100 and Glass-milk were used to extract genomic DNA from cosmetics. This method had advantages of less pollution， easy to operate， fast and high efficient. Then， the quality of genomic DNA was detected by UV spectrophotometer， PCR and DNA sequencing. The results showed that the concentration and purity of DNA both met the requirements of later molecular experiment. It indicated that the DNA exacted by this method was suitable for the detection of animal origin of cosmetics at the molecular level.

KeywordsCosmetics； Animal origin； Genomic DNA； Extraction method

近年來具有美容護膚功效的馬油、馬奶和驢奶等被廣泛應用于化妝品中，且此類化妝品倍受亞洲女性青睞。馬油的應用在我國歷史悠久，《名醫別錄》中記載馬脂肪具有生發護發作用，《本草綱目》中記載馬脂肪味甘、平、生發。馬油易被皮膚吸收且有美白作用，另外還有加速皮膚新陳代謝、增強細胞活力、抗皮膚衰老等功效[1]。馬奶被阿拉伯人視為“阿拉所賜的神藥”，歐洲貴婦人使用馬奶沐浴以保持皮膚光滑、美麗，馬奶洗面奶不僅能防止皮膚老化，還有消除皺紋的神奇功效[2]。驢奶中的VA、VE、VC和B族維生素抗氧化、抗衰老，可阻止細胞內不飽和脂肪酸氧化分解，阻止皮膚干燥和角質化，其中所含的芋堿酸可以使皮膚細白、柔嫩光滑、有彈性[3]。

由于馬油、馬奶和驢奶具有很好的美容功效，所以近年來馬油、馬奶和驢奶制品的價格均高于普通的牛奶制品，市場需求不斷擴大，在經濟利益的驅使下，部分沒有驢、馬資源的化妝品廠家用牛奶冒充驢奶和馬奶，甚至有的廠家的馬奶、驢奶化妝品中不含有任何動物源性成分，嚴重危害了消費者的健康和利益。

目前我國對化妝品中動物源性成分的檢測還比較薄弱。從分子水平上檢測化妝品中的動物源性成分是最準確有效的方法，而該方法首先需從化妝品中提取基因組DNA。由于化妝品特殊的加工工藝及所含成分復雜，其中的DNA成分已受到嚴重的破壞，這給DNA的提取帶來很大困難。本研究旨在建立一種能簡單、快速、高效地從化妝品中提取動物源性基因組DNA的方法，為化妝品中動物源性成分的檢測奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

市售不同品牌的馬和驢動物源性油膏、面膜、面霜、乳液和洗面奶等化妝品共20份。

1.2試劑與設備

Chelex-100為Sigma公司產品；Glass Milk為Thermo產品；DNA分子量Marker DL2000、TaKaRa PCR儀、電泳上樣緩沖液等購自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白酶K購自生工（上海）有限公司；5424D型高速離心機，Eppendorf公司；凝膠成像儀，BIO-RAD公司。

1.3化妝品中動物源性DNA的提取

取液體狀（200 μL）、膏狀或固體（200 mg）化妝品樣品放入2 mL離心管中，加入5%的Chelex-100 280 μL及20 mg/mL蛋白酶K 20 μL，56℃保溫30 min以上，高速振蕩5～10 s；100℃水浴8 min，高速振蕩5～10 s；13 000 r/min離心3 min，將上清轉入新的離心管中（候選步驟，將溶液轉移至離心柱中，13 000 r/min離心1 min，收集液體），加入Glass Milk 20 μL及 gDNA Binding Buffer （6 mol/L NaCl） 600 μL，充分混勻，65℃水浴15 min，期間顛倒混勻幾次；室溫放置5 min，期間顛倒混勻幾次；4 000 r/min離心1 min，棄上清，留管底；70%（體積分數）酒精500 μL，洗滌，8 000 r/min離心1 min，重復此步驟2次；加入500 μL無水乙醇，吹打懸浮，洗滌，8 000 r/min離心1 min，棄上清；8 000 r/min離心 30 s，用10 μL槍頭吸走殘余液體，室溫干燥10 min；加100 μL TE （pH 7.0） 70℃水浴5 min，離心，吸取上清轉移至新的離心管中，使用Nanodrop核酸檢測儀檢測DNA的濃度和純度，要求濃度在1～20 ng/μL之間，OD值1.7～1.8之間，-20℃保存備用。

1.4牛、馬和驢通用引物的設計

從NCBI數據庫中分別下載牛、馬和驢3種動物的線粒體16S rDNA基因序列各10條，并進行同源性比對，選取同源性高的序列兩端利用Primer Premier 5.0軟件設計一對通用引物，F：5′-AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTA-3′，R： 5′-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3′，擴增片段長239 bp。

1.5常規PCR和DNA測序檢測

PCR擴增采用25 μL體系，其中含10×PCR Buffer （含2 mmol/L Mg2+）2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、5 U Taq酶0.2 μL、10 μmol/L正反向引物各1 μL，DNA模板2 μL，超純水16.3 μL。采用降落PCR程序進行擴增，將PCR產物純化回收，ABI 3730XL DNA測序儀測序（由山東省農業科學院測序中心完成）。

2結果與分析

2.1基因組DNA質量分析

檢測結顯示，從20份市售化妝品中提取的基因組DNA OD260/OD280在1.7～1.9之間，平均值為1.8；DNA濃度在14.8～27.8 ng/μL之間，平均濃度為19.8 ng/μL，純度及濃度均能達到后續PCR檢測的要求。

2.2PCR檢測結果

以20份市售化妝品中提取的DNA為模板，使用馬、牛和驢的通用引物進行PCR擴增，除空白對照無擴增條帶外，20份化妝品的DNA均有擴增，片段大小與目的片段一致，且條帶清晰。

2.3DNA測序檢測結果

20份市售化妝品PCR擴增產物經純化回收，進行測序驗證，結果顯示，只有1、7、8、10、11、14、17、18、19的測序峰圖單一，無套峰現象，表明這9份化妝品含有的源性成分單一，其他11

份均有套峰現象，表明其中含有不止一種動物源性成分。在NCBI上進行BLAST分析發現，7、10和11為牛源性成分，1、8、14、17、18和19為產品標示的源性成分。部分源性成分單一化妝品的測序峰圖見圖2-圖4。

3討論與結論

含有動物成分的產品包括化妝品中動物源性成分的檢測主要應用近紅外法[4，5]、ELISA[6]（酶聯免疫吸附反應）和PCR法[7]等。PCR法是目前常用的檢測方法，其中實時熒光定量PCR法依據物種特異性DNA序列，是當前物種源性鑒定的金標準。應用分子生物學方法檢測化妝品中的動物源性成分，首先需要從化妝品中提取基因組DNA，DNA的質量直接影響PCR擴增和DNA測序等后續試驗結果。紫外分光光度計測定可初步明確基因組DNA的濃度和純度，內源基因的PCR擴增能進一步確定提取DNA的純度和DNA中是

否存在抑制PCR反應的物質，有效避免PCR反應出現假陽性結果[8]。

以往報道的從化妝品中提取基因組DNA的方法多使用氯仿、異戊醇、甲醇和四氫呋喃等有害試劑[9]，且耗時長，操作繁瑣，本研究所使用的Chelex-100和Glass Milk等試劑無毒、提取耗時短、操作簡單，具有快速、簡單、高效、適用范圍廣（適用于液狀、膏狀和固態等不同狀態化妝品中DNA的提取）等優點。

應用本方法提取20份市售化妝品基因組DNA，紫外分光光度法檢測OD260/OD280值在1.7～1.9范圍內，平均純度為1.8，平均濃度為19.8 ng/μL，表明基因組DNA的質量較好，并通過普通PCR法和DNA測序對提取的DNA進行驗證，結果表明本方法能快速有效地提取化妝品中的動物源性DNA。該方法為從分子水平檢測化妝品中的動植物源性成分奠定了基礎，同時可為相關監督部門對化妝品的監管提供幫助，具有重要的實踐性意義。參考文獻：

[1]張曉萍， 李華， 石慶華， 等. 馬油的透皮性能研究[J]. 新疆農業科學， 2010， 47（6）： 1257-1260.

[2]古麗巴哈爾·卡吾力， 高曉黎， 王玲，等. 新疆鮮馬奶粉的抗疲勞作用研究[J]. 安徽農業科學，2013，41（30）：12038-12039，12042.

[3]申超. 秋冬美容， 驢奶先行[J]. 新疆畜牧業， 2013（2）： 62.

[4]Ding H B， Xu R J. Near-infrared spectroscopy technique for detection of beef harburger adulteration[J]. Agric. Food Chem.， 2000， 48（6）：2193-2198.

[5]Murray I， Aucott L S， Pike I H. Use of discriminant analysis on visible and near infrared reflectance spectra to detect adulteration of fish meal with meat-and bone meal[J]. NIRS， 2001（9）：297-311.

[6]陸朱發， 邵劍挺. 用雙抗夾心ELISA鑒別不同肉類的研究[J]. 動物檢疫， 1993， 10（6）： 5-7.

[7]張全芳， 馬德源， 劉艷艷，等. 利用多重PCR技術檢測羊肉中摻雜狐貍肉的方法研究[J]. 山東農業科學， 2014，46（12）：4-6，10.

[8]邵碧英， 楊婕， 張體銀. 動物產品的DNA提取方法[J]. 畜牧與獸醫， 2005， 37（9）： 47-49.

[9]陳穎， 錢增敏， 王晶， 等. 一種從化妝品中提取DNA的方法： CN1904060A[P].