豬源豬鏈球菌耐藥情況分析

張維誼，王曉旭，寧 昆，徐 鋒，沈莉萍

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

豬源豬鏈球菌耐藥情況分析

張維誼，王曉旭，寧 昆，徐 鋒，沈莉萍

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

近年來，為掌握上海地區豬源豬鏈球菌的耐藥情況及耐藥規律，文章對2013～2015年畜禽門診、養殖場、屠宰場分離到的59株豬鏈球菌進行藥敏試驗。結合CLSI及獸醫臨床標準，選用8種抗生素，采用微量肉湯稀釋法（MIC）進行藥物敏感試驗。結果表明，豬鏈球菌對8種抗生素均產生不同程度的耐藥性，且耐藥程度很高在44%～95%之間，四環素耐藥率最高為95%，敏感率40%以上的有4種抗生素。部分藥物在臨床上，已經成為嚴重的耐藥，豬鏈球菌耐藥情況，呈逐年加重的趨勢。

豬鏈球菌 藥敏試驗 耐藥性 MIC

抗生素是一類對細菌、寄生蟲等具有抑制和殺滅作用的藥物，在畜牧飼料行業中已得到廣泛應用，在動物疫病防治、提高飼料轉化效率、促進畜禽生長方面發揮了重要作用。我國由于養殖密度大，畜禽疫病復雜多樣，且監管不力等多種原因，抗生素濫用現象較為嚴重，伴隨而來的耐藥問題越來越嚴重，給養殖業的持續健康發展埋下了隱患。

豬鏈球菌病是養殖業中最為常見的一種細菌性疾病。在實際養殖過程中，由于畜主對藥物的濫用，使得許多常用抗菌藥物出現了效果下降，甚至無效，給畜禽養殖業造成了嚴重的經濟損失［1］。與此同時，動物養殖過程中，濫用抗生素所帶來的影響，最終還是會通過各種途徑“轉嫁”到人身上，加劇抗生素耐藥性問題，影響著人類的健康。因此，對豬源豬鏈球菌進行耐藥性監測，掌握豬鏈球菌耐藥規律及變化情況，對指導臨床合理用藥，減少養殖戶經濟損失具有重要意義。

該研究對近年來上海地區的豬源豬鏈球菌進行了細菌的分離培養和鑒定，并對分離株進行了微量肉湯稀釋法藥物敏感試驗，研究了豬鏈球菌在上海地區的耐藥情況，為指導養殖戶臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 樣本及標準株

2013～2015年，來自上海地區養殖場鼻棉拭子、屠宰場扁桃體樣本和上海市動物疫病預防控制中心畜禽門診接收的發病畜禽病料（心、肝、脾、肺和腎臟）。豬鏈球菌藥敏實驗質控標準株ATCC43300購買自中國獸藥監察所。

1.2 主要試劑與儀器

革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術有限公司；Columbia血瓊脂基礎購自北京陸橋技術有限責任公司；無菌羊血購自上海閔行區諸翟無菌動物血試劑供應站；革蘭氏陽性細菌鑒定卡（GP）購自法國梅里埃公司；豬鏈球菌藥敏板（含8種抗菌藥物）由天津金章科技發展有限公司訂制；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；Premix購自TaKaRa公司，還有全自動微生物生化鑒定系統（VITEK2-Compact）和普通PCR儀（BioRad PTC-200）。

2 方法

2.1 細菌分離培養

按要求將樣本涂抹接種于Columbia血平板（加入1μL/mL過濾除菌的NAD和5%～10%脫纖維綿羊血），在5%CO2培養箱中經36℃培養24～48 h，對可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢。挑取單個菌落，接種于Columbia血平板進行純培養，觀察菌落特征及染色特點。

2.2 細菌鑒定

參照文獻［2］合成豬鏈球菌的引物，PCR反應體系為25μl：premix 12.5μl、引物各0.5μl、ddH2O 8.5μl、模板2μl。反應條件為：94℃預熱5 min、94℃30 s、56℃30 s、72℃1 min，擴增30個循環；72℃延伸10 min。

2.3 藥敏試驗

2.3.1 菌液制備

用滅菌棉簽取適量待測菌，懸浮于3 ml 0.45%NaC溶液中，用比濁儀調整細菌的濃度，使其麥氏單位達到0.48～0.52。同時，用ATCC43300作為試驗質控菌株。

2.3.2 菌液接種

首先從12 ml肉湯管中，吸取100μl加到空白對照孔，然后吸取待測菌液100μl到剩余的12 mL肉湯管中，混勻，加100μl到其余各孔。質控菌株操作同待測菌。

2.3.3 孵育

將藥敏板置于墊有濕紗布的瓷方盤內，36℃溫箱孵育16～18 h。

2.3.4 結果判定

在襯有黑底板的光線下觀察，無細菌生長的孔內所含最低抗菌藥物濃度，即為最低抑菌濃度（MIC）。結果判定及質量控制參照CLSI標準。

3 結果

3.1 耐藥率

豬鏈球菌的耐藥性 59株豬鏈球菌，對8種抗生素的藥敏試驗結果見表1。

3.2 多重耐藥性和耐藥譜

根據藥敏試驗結果，對豬鏈球菌試驗菌株多重耐藥性進行分析，獲得其耐藥譜（表2）和耐藥譜型（表3），共有耐藥譜型25種。

表1 59株豬鏈球菌MIC藥敏試驗結果

表2 59株豬鏈球菌耐藥譜

表3 豬鏈球菌耐藥譜型

3.3 豬鏈球菌耐藥趨勢

選擇8種抗生素，對豬鏈球菌的耐藥趨勢進行分析（圖1）。

4 分析

由59株細菌的耐藥率分析，豬鏈球菌對8種抗生素均產生不同程度的耐藥性，耐藥率在44%～95%之間，耐藥率80%以上的藥物有2種，四環素耐藥率將近95%，其余6種均在50%左右，耐藥率達54.24%。敏感率40%以上的有4種抗生素，最高的僅為44.07%，頭孢噻呋作為第3代動物專用頭孢菌素，耐藥率已達到54%以上，說明豬源豬鏈球菌的耐藥情況嚴重。

耐藥譜分析顯示，1耐到8耐的菌株都有，最少的為3耐和4耐，其次為1耐和7耐，8耐的菌株數最多，達20%以上，僅1株菌株沒有產生耐藥性。該研究共出現耐藥譜型25種，譜型較多，說明豬鏈球菌的耐藥情況較為復雜，濫用抗生素較為嚴重，提示在臨床應加強藥物的合理使用和指導。

四環素和紅霉素的耐藥率一直居高不下，其余6種抗生素的耐藥率從2013年至2015年均有增加，環丙沙星、氧氟沙星呈逐步升高趨勢。頭孢噻呋的耐藥率從2013年的25%到2014年以來的60%，增加幅度最大。2013年，耐藥率在25%有5種抗生素，到2015年，均在44%以上。

抗生素在防治畜禽疾病方面發揮了較大作用，但伴隨而來的耐藥問題及公共衛生問題也日益嚴重。加強對細菌耐藥性的監測、管理和技術支持，對細菌耐藥性的控制，具有重要意義。

首先是監測方面。應建立健全監測網絡，提高監測水平和監測質量，保證及時、完整、準確地獲得我國細菌耐藥性數據，用監測結果指導養殖戶，更加科學合理的使用抗生素［3］。

圖1 59株2013～2015年豬鏈球菌不同藥物耐藥率

其次是管理方面。要控制和管理制藥企業在畜牧養殖業中的不合理銷售及競爭行為，并對基層獸醫從業人員進行有效監管，加強教育培訓工作，提高理論知識，防止抗生素濫用、亂用現象的發生。

最后是技術層面。臨床上可以使用一些中草藥，用來減少抗生素的使用。例如，金銀花對耐青霉素的金黃色葡萄球菌有增敏作用，在低于抗菌濃度時，還能增強白細胞的吞噬能力，對青霉素抗菌有增效作用；葛根芪連湯與氨芐青霉素、頭孢哌酮、諾氟沙星配用均有協同作用。同時，也可以探索新的抗菌治療方法，如抗生素的輪流替用和聯合用藥，以應對細菌耐藥性問題。

［1］ 江飆，董嘉文，張獻杰，等.廣東地區動物源性大腸桿菌的分離及藥敏分析.中國獸藥雜志，2009，43（1）：14～16

［2］ 李小軍.上海地區豬鏈球菌致病性血清型及其毒力因子的流行病學調查.南京農業大學，2007

［3］ 劉海林，武新國.大腸桿菌的藥敏試驗報告.當代畜牧，2014，（11）：70～71