大鼠肝纖維化和肝硬化MR-PWI參數與CD34和a-SMA的相關性

孟令平， 王國光， 胡明秀， 張洪， 官兵， 洪玉萍

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·實驗研究·

大鼠肝纖維化和肝硬化MR-PWI參數與CD34和a-SMA的相關性

孟令平， 王國光， 胡明秀， 張洪， 官兵， 洪玉萍

目的：探討大鼠肝纖維化、肝硬化模型磁共振灌注成像(MR-PWI)參數的意義及其與CD34、a-SMA的相關性。方法：清潔級SD大鼠隨機分為實驗組(n=84)和對照組(n=16)。實驗組采用硫代乙酰胺(TAA)腹腔定點注射，每次200 mg/kg，3次/周，對照組同期腹腔注射同劑量的生理鹽水。建模第6～30周后實驗租和對照組分批次行肝臟磁共振常規掃描及灌注成像。病理上將鼠肝損傷分為肝纖維化0期、Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期、肝硬化結節期，并與灌注參數TTP、WIR、WOR和免疫組化指標CD34、a-SMA表達作對照。結果：共有69只大鼠(實驗組57只，對照組14只)成功獲取MR-PWI參數，成功率69%(69/100)。實驗組門靜脈和肝實質的TTP隨著肝纖維化及肝硬化進展而延長，而門靜脈WIR、WOR在肝纖維化Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期下降不明顯，肝硬化結節期則明顯下降；肝實質WIR、WOR則隨著肝纖維化、肝硬化進展而逐漸下降，各期之間差異有統計學差異(P<0.05)；各灌注參數與肝纖維化病理分期之間有較好相關性(P<0.05)。CD34和a-SMA表達在肝纖維化Ⅰ～Ⅱ期不明顯，肝纖維化Ⅲ～Ⅳ期和肝硬化結節期則明顯表達，與對照組比較，實驗組肝纖維化Ⅲ～Ⅳ期和肝硬化期CD34、SMA表達均顯著增加(P<0.01)。門靜脈及肝實質灌注參數TTP、WIR、WOR和CD34、a-SMA表達有相關性(P<0.05)。結論：門靜脈和肝實質TTP、WIR、WOR與大鼠肝纖維化、肝硬化不同分期之間有相關性，與CD34、a-SMA表達有相關性。

磁共振成像； 灌注加權成像； 肝纖維化； 肝硬化； 動物模型； 病理； 免疫組化

材料與方法

1.實驗動物與分組

選用清潔級SD大鼠100只(上海睿太莫斯生物科技有限公司提供)，雄性，鼠齡6～7周，體質量180～200 g，在上海農林職業技術學院動物實驗中心按標準方法飼養。大鼠隨機分為兩組：實驗組(n=84)，硫代乙酰胺 (上海凌峰化學試劑有限公司)200 mg/kg，腹腔注射，3次/周，連續8周；第9周開始，增加20%，連續至第25周；第26周開始，再增加20%，連續至第30周。對照組(n=16)，正常喂飼，與實驗組同樣時間于腹腔內注射同量生理鹽水。

2.磁共振檢查

Philips Achive 1.5T超導型MR儀，小動物專用線圈。腹腔內注射10%水合氯醛(2 mg/kg)麻醉大鼠，棉紗布輕裹動物腹部后，頭先進，俯臥置于線圈中央，試驗組大鼠(6±1)～(30±1)周后批次(1～5只/次)、對照組同期(1～2只/次)行磁共振常規橫軸面T1WI、抑脂T2WI檢查。

灌注成像技術：抑脂THRIVE(3D T1-TFE)序列，TR 7.5 ms，TE 3.7 ms，翻轉角10°，采集次數1，矩陣128×128，層厚2.0 mm，層間隔0 mm。全肝掃描層數10層，共55個時相，掃描時間120 s。由鼠尾靜脈經留置針團注對比劑Gd-DTPA(0.5 mmol/mL；北陸藥業)0.1 mL，隨后續注0.5 mL生理鹽水沖管，注射對比劑同時開始PWI掃描。原始灌注圖像傳入后處理工作站，采用“Basic T1 Perfusion”軟件包，分別選擇腹主動脈、門靜脈和肝實質作為興趣區(ROI)，自動繪制時間-信號強度曲線(time-signal intensity curve，TIC)。觀察并記錄：峰值時間(time to peak，TTP)，T0和峰值強度時間(T1)之間的時間；流入速率(wash in rate，WIR)，T0和峰值強度時間T1之間的最大斜率。流出速率(wash out rate，WOR)，峰值強度時間T1和測量末端之間的最大斜率。

3.病理學檢查

所有大鼠均于全麻下切下肝組織，經10%甲醛固定后石蠟切片，行HE染色和Masson染色，2位病理醫師鏡下觀察肝匯管區、肝竇壁及中央靜脈等處膠原纖維增生情況。按文獻[6]判斷肝纖維化程度：0級為無成纖維細胞增生，膠原纖維量正常；Ⅰ級為匯管區擴大，少量成纖維細胞增生，膠原纖維輕度增生；Ⅱ級為匯管區內成纖維細胞增生，膠原纖維呈條狀延伸；Ⅲ級為匯管區內成纖維細胞大量增生，膠原纖維形成小葉纖維隔；Ⅳ級為伴肝硬化假小葉形成。肝硬化結節期：大體觀彌漫肝結節(直徑≥2 mm)及鏡下增生結節。

圖5為Activiti引擎的系統服務結構圖，給出了引擎提供的所有功能組件。ProcessEngineConfiguration是配置管理類，管理的對象包括ProcessEngine、XXservice和數據庫session等。對于ProcessEngineConfiguration的配置，Activiti默認從activiti.cfg.xml中讀取，也可從Spring的配置文件中讀取。ProcessEngine提供有很多工作流方法的服務，都是線程安全的，下面對各服務的功能進行介紹。

4.免疫組化方法

SP法進行CD34、a-SMA免疫組化染色。鏡下按每張切片陽性細胞比例及著色深淺計分，進行半定量分析。陽性細胞著色判定(A) ：低于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2 分，51%～75%為3分，高于75%為4分；陽性強度判定(B)：無著色或與背景均勻一致的呈淡黃色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據兩項指標的積分數(積分= A×B)進行結果判定。結果由2名病理醫師雙盲判定，意見不一致時，由資深病理醫師最終確定。

5.統計學處理

結　果

1．MR-PWI成功率及病理結果

建模過程中，55只實驗組大鼠和14只對照組大鼠成功完成肝臟MR-PWI檢查，成功率分別為65%(55/84)和87%(14/16)。55只實驗組大鼠肝臟病理學分期：肝纖維化0期14只，肝纖維化Ⅰ～Ⅱ期19只，肝纖維化Ⅲ～Ⅳ期22只，肝硬化結節期14只。

2．MR-PWI表現

共69只大鼠獲較滿意肝灌注圖像。注射對比劑后PWI圖像上腔靜脈、腹主動脈、門靜脈顯影，對照組肝實質灌注較均勻(圖1)。肝纖維化期大鼠門靜脈灌注曲線呈速升緩降型，峰值出現時間較主動脈晚，幅度較小；肝實質灌注曲線穩定，波動小，動脈期上升緩慢(圖2)。肝硬化結節期門靜脈灌注曲線上升較快并達峰值，下降慢略呈鋸齒峰；肝實質灌注曲線上升緩慢；肝硬化結節曲線上升較快，曲線穩定(圖3)。

3.門靜脈灌注參數變化

注：經t檢驗，肝纖維化各期與對照組比較有統計學差異(P<0.05)。

門靜脈TTP隨肝纖維化分期逐漸增加而增加，肝纖維化Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期、肝硬化結節期分別為(75.10±18.71)s、(83.79±23.24)s、(142.76±73.35)，與對照組(50.92±15.21)s相比，差異均有統計學意義(P<0.01，表1)。隨著肝纖維化分期逐漸增加，門靜脈灌注曲線最大上升斜率和最大下降斜率逐漸降低，對照組為(202.94±58.60)s和(51.64±18.10)/s；肝纖維化Ⅰ～Ⅱ期均值為(181.27±59.77)和(34.89±12.05)/s，肝纖維化Ⅲ～Ⅳ期為(162.96±91.15)和(43.52±26.32)/s，但差異無統計學意義(P>0.05)。而在肝硬化結節期，門靜脈灌注曲線最大上升斜率和最大下降斜率為(41.10±35.68)和(10.84±7.33)/s，與對照組相比，差異均有統計學意義(P<0.01)。

4.肝實質灌注參數變化

肝實質TTP隨肝纖維化分期逐漸增加而增加，肝纖維化Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期、肝硬化結節期分別為(88.27±13.91)s、(82.82±23.81)s、(183.54±84.19)，與對照組(41.81±21.19)s相比，差異均有統計學意義(P<0.01，表2)。而WIR和WOR則隨肝纖維化分期逐漸增加而遞減，在肝硬化結節期遞減最明顯，對照組為(126.11±44.54)和(42.95±17.02)L/s；肝纖維化Ⅰ～Ⅱ期為(87.82±30.26)和(20.08±9.30) L/s，肝纖維化Ⅲ～Ⅳ期為(91.95±40.04)和(18.82±10.29) L/s，肝硬化結節期為(26.06±15.68)和(4.76±2.93)L/s，與對照組相比，差異均有統計學意義(P<0.01)。

注：經t檢驗，肝纖維化各期與對照組比較有統計學差異(P<0.05)。

5．MR-PWI灌注參數與肝纖維化病理分期的相關性

門靜脈和肝實質TTP與肝纖維化分期呈正相關(r=0.686、0.681，P<0.01)，門靜脈WIR、WOR和肝實質WIR、WOR與肝纖維化分期呈負相關(r=-0.506、-0.507、-0.551、-0.758，P<0.01)。

6.CD34和a-SMA在肝纖維化分期中的表達

CD34在正常大鼠肝竇小血管內皮細胞呈棕黃色陽性表達(圖4)：隨著肝纖維化程度加重，陽性表達范圍逐漸擴大，呈多量棕褐色、竇壁連續陽性表達(圖5)。肝硬化結節期， CD34也呈較明顯陽性表達(圖6)；a-SMA 在對照組僅表達于小血管(圖7)；在肝纖維化期呈長梭形陽性表達(圖8)，肝硬化結節期的a-SMA肝內表達明顯(圖9)。與對照組比較，肝纖維化組和肝硬化組的CD34、a-SMA之間的陽性表達差異見表3。

7.灌注參數與CD34、a-SMA表達的相關性

門靜脈和肝實質TTP與CD34、a-SMA呈正相關(P<0.05，表4)；門靜脈和肝實質WIR、WOR與CD34、a-SMA呈負相關(P<0.05，表4)。

討　論

灌注加權成像(perfusion weighted imaging，PWI)能夠觀察肝臟微循環血流動力學變化，并對組織活性和功能進行評價[1-2]，本研究以TAA藥物誘導大鼠肝纖維化、肝硬化模型為實驗對象，采用對比劑團注示蹤法進行檢查，該方法能夠反映組織血液灌注情況，從而間接評價組織微血管分布情況[3-5]；免疫組化指標CD34、a-SMA也能夠反映組織微血管密度和竇性毛細血管化，因此，本研究結合對肝纖維化、肝硬化CD34、a-SMA的觀察，從而探討PWI參數及免疫組化指標對肝病損害程度的診斷效能。

表3　肝纖維化各期a-SMA、CD34表達與對照組比較

注：經t檢驗，肝纖維化各期與對照組比較有統計學差異(P<0.05)。

表4　門靜脈和肝實質灌注參數與CD34、a-SMA的相關性

正常肝組織主要為門靜脈供血，肝臟TIC曲線呈緩升緩降的特點，隨著肝纖維化、肝硬化發展，TIC曲線也逐漸出現速升緩降變化。灌注參數從不同角度反映了肝組織血流灌注情況，MTT代表對比劑通過組織所用時間，正常肝組織對比劑通過時間短，而肝纖維化、肝硬化期則使通過時間逐漸延長，其機理可能是肝纖維組織增生，假小葉形成造成肝血流異常，肝竇毛細血管化，不成對小動脈增多，竇后阻塞等，導致血管狹窄、閉塞，血流減慢，從而導致MTT時間延長；WIR代表由血管增強開始到增強峰值的斜率，WOR代表由血管增強峰值到第一循環結束時的斜率，兩者都是單位時間內對比劑流入或流出引起組織信號升高或降低幅度和速度的改變，其變化程度受組織內對比劑濃度的高低、血管通透性及血流速度等多項因素影響[6-11]，因此，肝纖維化、肝硬化不同時期的斜率參數變化均低于正常肝組織。本實驗顯示TTP、WIR、WOR參數隨著肝纖維化程度加重呈較為明顯的相關性，其中，TTP為正相關，WIR、WOR為負相關，與文獻報道一致[7，9]；但由于檢查設備不同，灌注參數的表達也不盡相同，肝臟為雙重血供，其灌注參數包括肝動脈和門靜脈系統，肝動脈、門靜脈灌注量以及肝的總灌注量等，其應用范圍和定量分析不盡相同，對肝纖維化的診斷價值也不盡一致[12]。本實驗受到檢查設備軟件限制，僅僅半定量分析了灌注參數TTP、WIR、WOR在不同時期肝纖維化、肝硬化中的數值變化，有其局限性，仍需進一步深入研究。

CD34、a-SMA均代表微血管密度和血管形成，文獻認為肝纖維化、肝硬化發生、發展過程與血供改變和肝竇毛細血管化有較為明顯的一致性[13-16]，本研究選擇免疫組化指標CD34、a-SMA，便于觀察肝纖維化、肝硬化時期的血供及血流變化情況，從而分析判斷肝纖維化、肝硬化進展程度。肝纖維化主要病理改變是肝內細胞外間質(extracellular matrix，ECM)過度合成和異常沉積，從而導致肝纖維化，而肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是ECM 的主要來源，當HSC 被激活并轉化為肌成纖維細胞即表達a-SMA，并合成大量ECM，因此HSC 活化增殖被認為是肝纖維化形成的中心環節，其中a-SMA是活化HSC的特異性標志物，其表達強度與肝纖維化分期呈正相關[16-17]，因此，將a-SMA表達可客觀反映肝纖維化、肝硬化嚴重程度。肝纖維化早期，a-SMA表達主要發生在擴大的匯管區以及肝竇周隙細胞區域；隨著肝纖維化程度加重，a-SMA表達也逐漸明顯，肝硬化晚期出現新生及不成對的血管，形成較多閉塞血管及膽管纖維瘢痕，其纖維隔內的a-SMA表達呈強陽性，動物實驗表明，隨著造模時間延長，a-SMA表達與肝纖維化、肝硬化嚴重程度呈正相關，與文獻報道一致[16]。正常肝臟血竇不表達血管相關抗原，但隨著肝纖維化及肝硬化甚至癌變，各種血管相關性抗原表達逐漸明顯，一般認為這種變化與肝竇毛細血管化有關。本研究結果也證實隨著肝損傷的進展，肝竇中各種血管相關性抗原表達逐漸明顯，CD34在肝纖維化、肝硬化血竇中表達逐漸增加，其陽性表達與微血管密度范圍有關，正常肝實質為陰性或僅呈弱陽性，隨著肝纖維化、肝硬化進展，肝竇CD34陽性表達明顯增加，肝硬化結節晚期表現為彌漫分布的強陽性表達，反映了CD34的陽性表達與肝纖維化、肝硬化嚴重程度的相關性，本實驗結果與文獻報道一致[18-19]。

門靜脈與肝實質灌注參數以及免疫組化指標均能夠反映肝纖維化、肝硬化發展的嚴重程度，二者在肝纖維化、肝硬化分期判斷方面有一定的相關性，本組實驗得出灌注參數與CD34、a-SMA之間也有一定相關性。因此，兩種不同檢測指標均能反映肝纖維化、肝硬化的發展嚴重程度，為臨床判斷病情提供了較為可靠的依據。本研究存在不足之處：兩種指標均為半定量數據，有一定的主觀偏差，并且，受測量方法及設備參數限制，其遠期判斷效果仍有待于進一步驗證。

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The correlation of magnetic resonance perfusion parameters and CD34、 a-SMA of liver fibrosis and cirrhosis in rats

MENG Ling-ping,WANG Guo-guang,HU Ming-xiu,et al.

Department of Radiology,Jinshan Branch,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai 201599,China

Objective:To study the value of magnetic resonance perfusion-weighted imaging (PWI) parameters in rat models with liver fibrosis and cirrhosis,as well as their correlation with CD34,a-SMA expression.Methods:One hundred clear Sprague-Dawley (SD) male rats were randomly divided into experimental group (n=84) and control group (n=16).Thioacetamide (TAA) intraperitoneal injection,200mg/kg,3 times per week were performed in experimental group;while,0.9% sodium chloride solution of the same volume was injected into the abdominal cavity in control group.The rats both in experimental and control groups underwent conventional MRI and PWI on the 6～30th weekend after the modeling.Liver damage was divided into liver fibrosis stage 0,stage Ⅰ～Ⅱ,stage Ⅲ～Ⅳ,nodular cirrhosis pathologically.Correlation of time to peak (TTP),wash-in rate (WIR),wash-out rate (WOR) and CD34、 a-SMA expression in different stages of liver lesion were analyzed.Results:Totally sixty-nine rats including experimental group (n=57) and control group (n=14) had MR perfusion study performed successfully，with the success rate as 69% (69/100).In experimental group,TTP of portal vein and liver parenchyma prolonged along with the progress of liver fibrosis and cirrhosis，while WIR，WOR of portal vein were not decreased obviously in liver fibrosis stage Ⅰ～Ⅱ and Ⅲ～ Ⅳ,however,which decreased significantly in cirrhosis.The WIR,WOR of liver parenchyma declined gradually with the progress of liver fibrosis and cirrhosis,with significant statistic difference in different stages (P<0.05).The perfusion parameters showed correlation with the pathologic stages of liver fibrosis (P<0.05).CD34 and a-SMA expression were not obvious in liver fibrosis stage Ⅰ～Ⅱ,while which were significantly expressed in liver fibrosis stage Ⅲ～ Ⅳ and cirrhosis.Compared with the control group,CD34,SMA expression of experimental group stage Ⅲ～Ⅳ and cirrhosis increased significantly,with statistic difference (P<0.05).TTP,WIR,WOR and CD34,a - SMA expression in portal vein and liver parenchyma had significant correlation (P< 0.01).Conclusion:The TTP,WIR,WOR of portal vein and hepatic parenchymal showed good correlation in different stages of liver fibrosis and cirrhosis in rats as well as showing,correlation with CD34,a-SMA expression.

Magnetic resonance imaging； Perfusion weighted imaging； Liver fibrosis； Liver cirrhosis； Animal models； Pathology； Immunohistochemical

201599上海，上海市第六人民醫院金山分院放射科(孟令平、王國光、胡明秀、張洪)，病理科(官兵、洪玉萍)

孟令平(1963-)，男，湖北十堰人，碩士，主任醫師，主要從事腹部影像診斷和介入治療工作。

上海市科委醫學引導類項目基金(12119b1400)

R445.2； R575.2

A

1000-0313(2016)07-0580-06

10.13609/j.cnki.1000-0313.2016.07.002

2015-12-28)