KLF4基因沉默對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6膠原代謝的影響及機(jī)制研究

李濤　牛麗娟　劉文宣　楊磊　李曼　曹丹丹　彭亂順

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·論著·

KLF4基因沉默對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6膠原代謝的影響及機(jī)制研究

李濤牛麗娟劉文宣楊磊李曼曹丹丹彭亂順

目的探討大鼠KLF4基因沉默，對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6膠原代謝的影響及其機(jī)制。方法設(shè)計并構(gòu)建針對大鼠KLF4基因的3個干擾質(zhì)粒(pGPU6-1，pGPU6-2，pGPU6-3)以及陰性對照。采用實時熒光定量RT- PCR(Real-time RT- PCR )和western blot的方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，篩選出沉默最好的干擾質(zhì)粒,將篩選出來的干擾質(zhì)粒pGPU6-3，轉(zhuǎn)染大鼠HSC-T6細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h和48 h后分別采用Real-time RT-PCR法和western blot的方法檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA和蛋白的表達(dá)。Real-time RT-PCR法以GAPDH為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析計算。western blot的方法以β-actin蛋白為內(nèi)參照，進(jìn)行分析。結(jié)果Real-time RT- PCR結(jié)果顯示，pGPU6-3轉(zhuǎn)染大鼠HSC-T6細(xì)胞后，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TIMP-1相對于對照組的mRNA表達(dá)分別下降為0.358±0.038，0.298±0.041和0.478±0.048； 而MMP-13 mRNA的表達(dá)則上升為1.712±0.034。Western Blot檢測中，pGPU6-3轉(zhuǎn)染大鼠HSC-T6細(xì)胞后，以β-actin為內(nèi)參照，Ⅰ型膠原蛋白，Ⅲ型膠原蛋白和TIMP-1蛋白的表達(dá)分別下降為0.326±0.051，0.283±0.074和0.331±0.039；而MMP-13蛋白的表達(dá)則上升為1.273±0.038。結(jié)論KLF4基因沉默可以顯著減少大鼠HSC-T6細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)，其機(jī)制與增加MMP-13表達(dá)，而抑制TIMP-1的表達(dá)有關(guān)。

人肝星狀細(xì)胞；KLF4；Ⅰ型膠原；Ⅲ型膠原；MMP-13

肝纖維化的本質(zhì)是由于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成與降解不平衡所導(dǎo)致ECM的過度沉積。正常肝臟中ECM的主要成份是Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，Col Ⅰ)和Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ，Col Ⅲ)，其他膠原所占比例較少[1]。而肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells， HSCs) 是肝臟中的ECM的主要合成細(xì)胞，同時，HSCs還能分泌多種膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)以降解ECM，同時分泌基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)防止膠原過度降解，使肝臟ECM的合成和分解處在一個動態(tài)平衡中[2]。……