霍山石斛野生植株·組培植株與河南石斛葉表皮微形態特征研究

陳乃東，李 俊

(1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安 237012;2.皖西中藥與天然藥物工程技術研究中心，安徽六安 237012；3.安徽醫科大學藥學院，安徽合肥 230032)

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霍山石斛野生植株·組培植株與河南石斛葉表皮微形態特征研究

陳乃東1,2,3，李 俊3*

(1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安 237012;2.皖西中藥與天然藥物工程技術研究中心，安徽六安 237012；3.安徽醫科大學藥學院，安徽合肥 230032)

[目的]比較霍山石斛野生植株、組培植株與河南石斛的葉表皮微形態結構特征，為霍山石斛的真偽鑒定提供依據。[方法]在光學顯微鏡下，觀察霍山石斛野生植株、組培植株與河南石斛的葉表皮微形態結構，并測定氣孔器密度、分布及氣孔指數等。[結果]3種石斛葉的上表皮細胞多為規則的六邊形，霍山石斛野生植株、組培植株下表皮細胞為不規則形和近多邊形，河南石斛的下表皮細胞為多邊形，3種植物垂周壁式樣相似；3種石斛葉的上表皮均無氣孔，下表皮氣孔無規則分布，霍山石斛野生植株、組培植株與河南石斛氣孔長寬比分別為1.12、1.55、1.31，氣孔器密度分別為109、156、94個/mm2，氣孔指數分別為8.9%、12.5%、8.2%。[結論]霍山石斛野生植株、組培植株與河南石斛葉表皮細胞形狀、氣孔分布、垂周壁式樣均比較相似，難以作為分類的依據。氣孔器形狀、密度、大小表現出比較穩定的差異，可以作為這3種石斛之間區分的依據。

霍山石斛野生植株；霍山石斛組培植株；河南石斛；微形態特征；氣孔器密度；氣孔指數

霍山石斛(Dendrobium huoshannese Tang et Cheng)屬蘭科石斛屬多年生草本植物[1]，主產于安徽霍山、岳西、潛山等地，含多糖、生物堿及豐富的微量元素[2-7]，具有生津益胃、抗腫瘤、抗白內障等多種功效[2]，是安徽道地藥材之一。由于霍山石斛自然狀態下萌芽率低、生長緩慢，加上長期過度采挖，其野生資源已瀕臨滅絕[8-9]，市價高達30萬～40萬元/kg。在霍山石斛的道地產區，采用組培快繁快速獲得試管苗或人工誘導種子萌發產生實生苗大規模野外栽培的組培霍山石斛，已逐漸替代野生資源成為藥用霍山石斛的主要來源[2,4,6-7]。近期的研究熱點主要集中在霍山石斛藥用有效成分分析、引種馴化、人工種植、組織培養等方面[2,4,6-7]，對其品種鑒定鮮有報道。當前市場上霍山石斛偽品很多，亟需構建一套方法用于霍山石斛藥材鑒定。

植物的葉表皮微形態特征具有較高的遺傳穩定性，含有豐富的分類信息，可用于植物種間或屬間分類及其系統關系探討[10-13]，且只需要少量的植物葉片便可開展研究。霍山石斛組培植株、野生植株二者具有相同的遺傳信息和高度相似的形態學特征，但由于種源不同(組培植株來自與試管苗野外馴化栽培，而野生植株來自自然狀態下種子繁殖生長)，二者的藥效物質基礎存在明顯差異[3-6]。作為霍山石斛的近緣種——河南石斛(Dendrobium henanense J.L.Lu et L.X Gao)，與霍山石斛具有極為相似的形態和不同的次生代謝產物組成，在石斛市場上為霍山石斛的主要偽品，因此，研究不同種源的霍山石斛與河南石斛微形態特征差別，構建霍山石斛快速鑒定方法，對霍山石斛產業的發展具有重要意義。目前對霍山石斛、河南石斛葉表皮微形態特征的研究尚未見報道。該試驗擬對霍山石斛的野生、組培植株及河南石斛葉表皮微形態特征進行初步研究，為霍山石斛的真偽鑒定提供參考依據。

1　材料與方法

1.1試材試驗材料于2014年10月采自安徽省霍山縣太平畈鄉，品種經安徽省省級2011協同創新中心——霍山石斛產業化開發協同創新中心主任陳乃富教授鑒定為組培霍山石斛(tissue-cultured Dendrobium huoshanense)、野生霍山石斛(wild Dendrobium huoshanense)、河南石斛(Dendrobium henanense)。

1.2儀器和試劑光學顯微鏡(BM200，南京江南永新光學有限公司)。次氯酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)、番紅(AR，國藥集團化學試劑有限公司)、無水乙醇(AR，上海振興化工一廠)、二甲苯(AR，廣東翁江化學試劑有限公司)、中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3試驗方法

1.3.1葉表皮裝片的制備。取完整成熟葉片剪取中部中脈兩側約5 mm×5 mm的小塊，用水煮沸5～10 min后置于30%NaClO溶液中浸泡至顏色發白后取出，用蒸餾水反復清洗后輕輕剝離葉片的上下表皮，轉移到一塊滴有蒸餾水的潔凈載玻片上，將葉表皮展開，除去水分，滴加1%番紅溶液染色30.0 min。35%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇梯度脫水，二甲苯∶乙醇(1∶1)溶液透明處理后中性樹膠封片[14-15]。顯微鏡觀察、拍照、測量。

1.3.2指標統計。

1.3.2.1氣孔大小及長寬比。取葉表皮封片置于光學顯微鏡下，隨機測 30個氣孔大小、長寬比，求它們的平均值。

1.3.2.2氣孔分布特征。將葉表皮封片置于光學顯微鏡下，觀察氣孔分布特點。

1.3.2.3氣孔密度。取葉表皮封片置于光學顯微鏡下，觀察單位面積內氣孔個數，計算氣孔密度，其計算公式為D=S/M，式中，S為固定面積內氣孔數目，M為固定面積。

1.3.2.4氣孔指數。取葉表皮封片置于光學顯微鏡下，隨機觀察5個視野，統計單位視野氣孔數(S)和單位視野普通表皮細胞數(P)，根據公式I=S/(S+P)×100%計算氣孔指數(I)。

2　結果與分析

由圖1可見，霍山石斛野生植株、組培植株與河南石斛葉下表皮氣孔無規則分布，葉片上表皮均無氣孔。霍山石斛組培植株與河南石斛葉表皮氣孔縱軸多與葉脈平行，霍山石斛野生植株葉表皮氣孔縱軸部分與葉脈平行；霍山石斛野生植株氣孔近圓形(長寬比為1.12)、組培植株氣孔器為長橢圓形(長寬比為1.55)，河南石斛氣孔為寬橢圓形(長寬比為1.31)。3種石斛樣品氣孔器長度從大到小依次為河南石斛、霍山石斛組培植株、霍山石斛野生植株(表1)，霍山石斛組培植株和野生植株在細胞器微形態特征的差異說明種源對霍山石斛葉表皮微形態特征可能產生一定的影響，市場上霍山石斛主要偽品——河南石斛與霍山石斛氣孔器形狀差異可為霍山石斛真偽鑒定提供參考依據[15]；霍山石斛野生植株與河南石斛的氣孔器密度和氣孔指數較為接近，但明顯低于霍山石斛組培植株(表1)，與霍山石斛組培植株生長速度顯著高于霍山石斛野生植株與河南石斛相一致，可用于霍山石斛組培植株和野生植株鑒定的輔助依據。

從表2可看出，霍山石斛野生、組培植株下表皮細胞形狀相似，均為不規則、近多邊形，河南石斛的下表皮細胞為多邊形； 3種石斛的上表皮細胞形狀相似，均為多邊形，且多為規則的六邊形，上表皮細胞略大于下表皮細胞；霍山石斛野生植株和組培植株下表皮垂周壁式樣均為近平直、弧形，上表皮垂周壁式樣為近平直、較厚，河南石斛的上、下表皮垂周壁式樣均為近平直、平直。

注：a.霍山石斛野生植株下表皮；b.霍山石斛野生植株上表皮；c.霍山石斛組培植株下表皮；d.霍山石斛組培植株上表皮；e.河南石斛下表皮；f.河南石斛上表皮。Note：a.Lower epidermis of wild D.huoshanense;b.Upper epidermis of wild D.huoshanense;c.Lower epidermis of tissue-cultured D.huoshanense;d.Upper epidermis of tissue-cultured D.huoshanense;e.Lower epidermis of D.henanense;f.Upper epidermis of D.henanense.圖1　霍山石斛野生植株、組培植株與河南石斛葉表皮微形態特征(400倍)Fig.1　The micro-morphology characters of the leaf epidermis of wild D.huoshanense,tissue-cultured D.huoshanense and D.henanense

表2　霍山石斛野生、組培植株與河南石斛葉表皮微形態特征

3　結論

該研究利用光學顯微鏡觀察霍山石斛野生植株、組培植株與河南石斛的葉表皮微形態結構，并測定其氣孔器密度、分布及氣孔指數等，比較霍山石斛野生植株、組培植株與河南石斛的葉表皮微形態結構特征。結果表明，3種石斛葉的上表皮細胞形多為規則的六邊形，霍山石斛野生植株、組培植株下表皮細胞為不規則形和近多邊形，河南石斛的下表皮細胞為多邊形；3種植物垂周壁式樣相似；3種石斛葉的上表皮均無氣孔，下表皮氣孔無規則分布，霍山石斛野生植株、組培植株與河南石斛氣孔長寬比分別為1.12、1.55、1.31，氣孔器密度分別為109、156、94個/mm2，氣孔指數分別為8.9%、12.5%、8.2%。可見，霍山石斛野生植株、組培植株與河南石斛葉表皮細胞形狀、氣孔分布、垂周壁式樣均比較相似，難以作為分類的依據。氣孔器形狀、密度、大小表現出比較穩定的差異，可以作為這3種石斛之間區分的依據。

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Micro-morphological Characters of Leaf Epidermis of Wild and Tissue-cultured Dendrobium huoshanense Tang et Cheng and Dendrobium henanense

CHEN Nai-dong1,2,3,LI Jun3*

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,West Anhui University,Lu’an,Anhui 237012;2.West Anhui Biotechnology Research Center of Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine,West Anhui University,Lu’an,Anhui 237012;3.School of Pharmacy,Anhui Medical University,Hefei,Anhui 230032)

[Objective]To compare the micro-morphological characters of leaf epidermis of wild and tissue-cultured Dendrobium huoshanense Tang et Cheng and Dendrobium henanense,and to provide

for the identification of D.huoshanense.[Method]Under optical microscope,leaf epidermis of wild and tissue-cultured D.huoshanense as well as D.henanense were observed and researched,and the corresponding quantitative index were detected.[Result]The upper epidermal cell shapes of the three Dendrobium samples were mostly regular hexagon,the lower epidermal cells were irregular for wild and tissue-cultured D.huoshanensewhile polygonal for D.henanense.Anticlinal walls of upper and lower epidermis were almost straight;All the three plants had stomata apparatuses in lower epidermis with irregular arrangement,which showed 1.12,1.55,1.31 length to width ratio,109,156,94/mm2stomata density,8.9%,12.5%,8.2% stomata index of wild D.huoshanense,tissue-cultured D.huoshanense and D.henanense,respectively.[Conclusion]Relatively stable differences were showed in the shape,size and density of the stomata apparatus in the leaf epidermis of wild D.huoshanense,tissue-cultured D.huoshanense and D.henanense,which could be used as the basis for the discrimination of the three plants.The shapes of leaf epidermis cells and distribution of stomata apparatus are quite similar and thus can’t be used to discriminate the three investigated Dendrobium samples.

Wild Dendrobium huoshanense;Tissue-cultured Dendrobium huoshanense;Dendrobium henanense;Micro- morphology characters;Stomatal density;Stomatal index

中國博士后基金(第9批)特別資助項目(2016T90559)；國家自然科學基金項目(81274021，81573536)；安徽省自然科學基全面上項目(1608085MH221);安徽省教育廳自然科學研究重點項目(KJ2016A886)。

陳乃東(1972- )，男，安徽金寨人，副教授，博士后，從事中藥藥效物質基礎、質量標準及質量控制研究。*通訊作者，教授，博士生導師，從事免疫藥理研究。

2016-07-06

S 567.23

A

0517-6611(2016)25-186-03