液體食品包裝用塑料復合膜、袋微生物檢驗方法的研究

北京市射線應用研究中心（101113）李娜 陳堅 燕瑾 郝松松

近年來，食品安全事件頻發，其中微生物超標造成人身傷害在其中占很大比例，在排除產品自身因素影響之外，包裝材料對于產品的影響是最直接的。現行國家標準GB19741：2005針對《液體食品包裝用塑料復合膜、袋》類產品日常微生物檢驗引用國家標準GB/T4789.2菌落總數測定方法。但在微生物日常檢測中發現，此方法對于液體食品包裝用塑料復合袋適用性并不強。

本研究選取了三種不同的微生物檢驗方法，對同一廠家生產的不同規格的液體食品包裝用塑料復合袋進行為期1年的生物負載量的對比實驗，同時每種方法選取兩種洗脫液進行微生物洗脫。

通過檢測，發現灌裝薄膜過濾法相較于棉拭子涂抹及稀釋直接傾注法更能有效地將液體食品包裝用塑料復合袋上的微生物洗脫下來，降低了微生物負載的檢出限，提高了檢出率。洗脫液的不同種類，對檢出結果未有顯著差異。一年四季不同的溫、濕度生產條件下生產的產品，產品生物負載未顯現季節性差異。

1 實驗材料和實驗方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品 某一生產廠家液體食品包裝用塑料復合袋：8L、20L、50L、220L四種規格。

1.1.2 儀器 ①冰箱（0℃～4℃）：海爾電器提供。②恒溫培養箱（32℃、24℃）：上海一恒科學儀器有限公司提供。③電子天平：0g～1000g，精確至0.1g。上海精密科學儀器有限公司提供。④座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械生產廠提供。⑤電熱鼓風干燥箱（10℃～250℃）：上海一恒科學儀器有限公司提供。

1.1.3 試劑 ①平板計數培養基：北京陸橋技術有限責任公司提供。②PH7.0滅菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液：北京陸橋技術有限責任公司提供。③滅菌蒸餾水。④大腸埃希菌 CMCC（B）44 102：杭州微球生物技術有限公司提供。⑤金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26 003：杭州微球生物技術有限公司提供。⑥枯草芽孢桿菌：CMCC（B）63 501：杭州微球生物技術有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 方法一：GB/T4789.2食品微生物學檢驗 菌落總數測定。

1.2.1.1 剪取液體食品包裝用塑料復合袋內雙層透明膜25g分別置盛有225ml生理鹽水及氯化鈉蛋白胨緩沖溶液的無菌三角瓶內，置于搖床震蕩30分鐘，制成1：10的樣品勻液。

1.2.1.2 選擇1∶10、1∶100、及1∶1000比例稀釋液，吸取1ml至平皿中，及時將15mL～20mL冷卻至46℃的平板計數瓊脂培養基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。35℃培養2～4天，每天觀察。

1.2.2 方法二：2010版《中華人民共和國藥典》附錄Ⅻ G微生物限度檢查法（薄膜過濾法）。

1.2.2.1 以無菌操作，分別將150ml、250ml、450ml、950ml滅菌生理鹽水及滅菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液，從袋口處加入到8L、20L、50L、220L不同規格液體食品包裝用塑料復合袋內，震蕩30分鐘備用。

1.2.2.2 以無菌操作，用滅菌孔徑0.45μm，直徑50mm的微孔濾膜過濾浸泡實驗樣品的緩沖液，并用滅菌蛋白胨緩沖溶液沖洗濾膜，將濾膜放到平板計數瓊脂培養基上進行培養。35℃培養2～4天，每天觀察。

1.2.3 方法三：棉拭子擦拭法（10cm×10cm）。

1.2.3.1 以無菌操作，剪開液體食品包裝用塑料復合袋，將滅菌10cm×10cm規格板貼在最內層膜上，在框內用滅菌棉拭子擦拭，裝入100ml滅菌生理鹽水及滅菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液中，震蕩混勻。

1.2.3.2 以無菌操作，用滅菌孔徑0.45微米，直徑50毫米的微孔濾膜過濾浸泡棉拭子的緩沖液，并用滅菌蛋白胨緩沖溶液沖洗濾膜，將濾膜放到平板計數瓊脂培養基上進行培養。35℃培養2～4天，每天觀察。

附表1 四種規格液體食品包裝用塑料復合袋用三種方法，兩種不同的洗脫液進行微生物洗脫，在1、2季度培養結果。

附表2 四種規格液體食品包裝用塑料復合袋用三種方法，兩種不同的洗脫液進行微生物洗脫，在3、4季度培養結果。

附表3 同種規格體食品包裝用塑料復合袋包裝不同產品反復洗脫后菌落總數結果

1.2.4 反復洗脫實驗

1.2.4.1 取5件220L液體食品包裝用塑料復合袋，分別以無菌操作，從注水口分別將定量菌株（50～100cfu）加入液體食品包裝用塑料復合袋內，干燥。

1.2.4.2 以無菌操作，將950ml滅菌生理鹽水從注水口分別加入液體食品包裝用塑料復合袋中，充分震蕩浸泡產品30分鐘后，用滅菌孔徑0.45微米，直徑50毫米的微孔濾膜過濾浸泡實驗樣品的緩沖液，并用滅菌蛋白胨緩沖溶液沖洗濾膜，將濾膜放到平板計數培養基上進行培養。35℃培養2～4天，每天觀察。

1.2.4.3 將這5件產品反復以1.2.4.1的方法操作五次。

2 實驗結果

液體食品包裝用塑料復合袋4種規格：8L、20L、50L、220L，按月份，分季度用三種方法，兩種不同的洗脫液進行微生物洗脫并培養，結果如下。第一、二季度結果（見附表1）。第三、四季度結果（見附表2）。

2.1 結果分析 一年當中的四季，在不同溫、濕度環境下生產的液體食品包裝用塑料復合袋，微生物檢驗三種方法中，方法一使用GB/T4789.2中稀釋直接傾注法，其結果大都處于下限即＜10cfu/g，全年只有兩次的菌落總數結果為10cfu/g；方法二使用《中華人民共和國藥典》中提到的薄膜過濾操作方法，結果從＜1cfu/件到196cfu/件不等；方法三使用GB/T19973.1中提到的棉拭子擦拭的方法，所出結果大都為＜1cfu/100cm2，全年只有一次的菌落總數結果為1cfu/100cm2。三種方法中，每月同樣檢測方法對比發現，結果差異性不大。

2.2 反復洗脫結果（方法二），見附表3。

2.2.1 結果分析 通過反復洗脫實驗結果表明，校正因子為1.32，平均回收率為75.52%，大于50%，符合標準要求。由此證明薄膜過濾方法適用于液體食品包裝用塑料復合袋的微生物洗脫。實際檢出率進一步提高。

3 結果討論

3.1 對于結果數據的討論

3.1.1 歷時一年的檢測，對于上述三種不同的微生物檢驗方法，其中方法一：GB/T4789.2是標準GB19741-2005液體食品包裝用塑料復合袋對于微生物檢驗要求的規定方法，其中要求檢驗“與食品接觸表面的菌落總數”，實際稱取的樣品包含與食品接觸表面和與非食品接觸表面，檢驗結果并非與食品接觸表面的菌落總數，而是與食品接觸表面和與非食品接觸表面兩面的菌落總數，故與GB19741-2005提出的標準要求不相符。由于所剪面積有限，對于規格較大的液體食品包裝用塑料復合袋的代表性并不充分，以及其稀釋的方法，所有檢出下限的報告值均為＜10cfu/g，如果樣品中菌落總數含量在10cfu以下，或者是由于微生物分布不均，所剪部分恰巧沒有微生物存在，都會導致結果不能真實反映產品本身微生物含量。

3.1.2 方法二：《中華人民共和國藥典》中以及GB19973.1中提到對于樣品的處理可以使用薄膜過濾方法，雖然此方法大部分應用于藥品以及醫療用品，但在長期的工作積累下發現此方法同樣適用于液體食品包裝用塑料復合袋以及其它封閉類的食品包裝袋，通過注水口注入洗脫液，封閉注水口反復震蕩洗脫30分鐘，使洗脫液充分接觸液體食品包裝用塑料復合袋與食品接觸面，所洗脫下的微生物系整件產品的菌落總數，相較于“個/cm2”更有說服力。

3.1.3 方法三：GB19973.1中提到對于樣品的處理可以使用棉拭子擦拭的方法，通過使用10cm×10cm規格板貼在與食品接觸面上，在框內用滅菌棉拭子擦拭，其報告結果雖然符合GB19741-2005中報告的要求，但是由于擦拭面積小，對于規格較大的液體食品包裝用塑料復合袋代表性不強，或者是由于微生物分布不均，所擦拭部分恰巧沒有微生物存在，都會導致結果不能真實反映產品本身微生物含量，以及有些收集到的微生物可能會被拭子本身組織所吸附從而不會檢測到，所以此方法不能真實的反映出產品上的微生物含量。

3.1.4 在標準GB19741-2005中要求最終細菌報告的單位為“個/cm2，是不符合的。世界衛生組織和新的微生物檢驗國家及國際標準中均建議使用“cfu”代表菌落而不是“個”。建議在GB19741—2005標準修訂時加以修改。

3.1.5 在使用不同方法對液體食品包裝用塑料復合袋微生物洗脫過程中，使用兩種不同的洗脫液，發現其結果差異性不大，故此類產品的微生物檢驗洗脫液種類對其的影響可以排除。

3.1.6 歷時一年的檢測中，菌落總數檢出量不因溫度的高低變化發生顯著地變化，故此可以排除溫度此類產品微生物洗脫的影響。

4 結論

本課題對于液體食品包裝用塑料復合袋微生物檢驗，通過對四種不同規格，兩種不同的洗脫液，三種不同的洗脫方法，歷時一年的監測，得出：首先，液體食品包裝用塑料復合袋在溫、濕度不同的各個季節，其菌落總數測量結果不會發生顯著地變化；其次，液體食品包裝用塑料復合袋的菌落總數測量結果不受洗脫液種類影響；第三，采取方法二（灌裝后薄膜過濾法）更能有效地將液體食品包裝用塑料復合袋與食品接觸面上的微生物洗脫下來，由于其檢出限低，檢出率高，其結果能更真實的反映出產品上微生物的含量。

在標準GB19741-2005中菌落總數測定規定的方法相較處于劣勢，且在標準GB19741-2005中要求最終細菌報告的單位為“個/cm2，與世界衛生組織和新的微生物檢驗國家及國際標準中均建議使用“cfu”代表菌落而不是“個”， 是不符合的。建議在GB19741—2005標準修訂時參考以上結論。