富鉻酵母誘變及突變株篩選研究

呼鳳蘭，賀瑩，趙建英

（呂梁學院生命科學系，山西呂梁033000）

富鉻酵母誘變及突變株篩選研究

呼鳳蘭，賀瑩，趙建英

（呂梁學院生命科學系，山西呂梁033000）

主要通過3種誘變方式對酵母進行誘變，這些誘變方式包括紫外照射、化學劑誘變和復合誘變，并篩選出高產耐鉻菌株。結果表明：通過紫外誘變，當誘變時間為100 s時，致死率達到80%，所以把100 s確定為最佳誘變時間，并篩選出了5株菌株，分別命名為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5；通過不同體積分數的DES對酵母進行誘變，最佳致死劑量是體積分數為4%的DES，與此同時，在這個酵母誘變過程當中，5株菌株被篩選分離出來；對酵母進行復合誘變時，選用4%的DES對待處理的菌樣進行處理，處理時間為25 min，再利用紫外照射對菌懸液照射60 s，篩選出長得好的10只菌株，命名為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10；針對上述經過單一誘變和復合誘變的菌株進行第二次篩選，選出鉻含量高的菌株F1、F2、F6、F9、Z1，其中F9的鉻含量最高，達到13.4 mg/g。

鉻；酵母；誘變；篩選

鉻作為一種對生物體有著不可或缺作用的微量元素。對人來講，隨著年齡的增大，生物代謝速度的減緩，伴隨細胞死亡，鉻在生物體內的含量逐漸減少。雖然人體內鉻含量很少，人體對其鉻的需求量小，但是鉻對人體的作用是至關重要的［1］。鉻能夠幫助胰島素放大其功能效應，不僅能夠加快細胞對葡萄糖的吸收速度，使人體在代謝過程中產生一系列的中間產物，進入不同的代謝途徑，產生大量的ATP（三磷酸腺苷），為人體的日?；顒犹峁┐罅康哪芰?，而且能夠降低血糖濃度，因此被稱作一種血糖調節劑。作為人體內一種重要的血糖調節劑，在血糖濃度調節方面，特別是對糖尿病患者而言有著不可言喻的重要作用［2］。除了在血糖調節方面有著重要地位外，鉻在人體的生長發育發面又有著其他微量元素不可替代的作用。鉻既有助于生長發育，還對血液中的一些激素有控制作用。

當前，國內國外對微量元素的吸收越來越關注。能夠富集微量元素酵母必然會引起人們的注意。酵母的這種能夠富集微量元素的性能給科學家們提供了無限的想象空間，使得他們在科學研究上看到了在人體微量元素吸收方面的一縷曙光。在日常食用方面，酵母富鉻食品漸漸深入人們的生活。富鉻酵母食品的出現使得國內外的專家開始思考，將本來就不易于吸收的鉻加入到各類食品中，通過轉基因的手段將富鉻酵母的基因插入到各類蔬菜水果當中，讓人們不再因為缺鉻而導致生病甚至死亡，讓人們不再擔心缺鉻［3］。此次實驗是在前人的研究基礎上來對酵母富集鉻進行的的深入研究，主要是利用紫外線誘變、化學誘變、復合誘變3種手段來對富含Cr3+的酵母進行傳代培養，篩選分離出好菌株［4］。以便使富鉻酵母進一步滿足工業生產化需求，提高產品質量。

1　材料與方法

1.1主要試劑

酵母菌：呂梁學院生命科學系實驗室提供。

液體培養基：即PDA培養基（potato dextrose agar）：馬鈴薯200 g（煮汁），葡萄糖20 g，無菌水1 L，pH自然。

固體培養基：液體培養基的基礎上加蛋白胨10 g。

發酵培養基：配方同液體培養基。發酵培養基分裝到容量為250 mL的搖瓶中，每個搖瓶中加900 μg/mL的鉻。

篩選平板培養基：PDA培養基中將不同濃度梯度的鉻加入其中。

硫酸二乙酯（DES）、鹽酸、高氯酸、硝酸、75%乙醇、硫代硫酸鈉、碳酸鈉、鉻標準液、三氯化鉻、磷酸二氫鉀、無水乙醇、硫酸鎂、瓊脂粉、葡萄糖一水、硫酸鎂、蛋白胨、氫氧化鈉：山西航科試劑有限公司。

1.2主要儀器

KDM型控溫電熱套：山東鄄城華魯儀器公司；TX323L型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Neofuge 13型臺式高速離心：上海力申科學儀器有限公司；ZYW-100D型恒溫培養振蕩器、ZXSD型生化培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；CSIO UV4C型多用臺式暗箱紫外分析儀：北京賽百奧科技有限公司；XH-C型漩渦混合器：金壇市白塔新寶儀器廠；VIS-723N型紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司；G-2X-9146MBE型電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3方法

1.3.1生長曲線的測定

先將冷藏的菌種取出，用接種環在斜面培養基上挑一環菌，接種在液體培養基中，放在振蕩培養箱中，把溫度設置成28℃，轉速設成180 r/min，在此種培養條件下培養24 h，每隔2 h從培養基中取2 mL菌液在600 nm處測吸光度［5］。

1.3.2菌體濃度的測定

用血球計數板來計數。

1.3.3誘變育種

1.3.3.1菌種的活化

將菌株連續傳代兩次，此時菌體就已經活化，可以使用［6］。

1.3.3.2酵母細胞懸液的制備

挑一環活化好的菌接種于上述液體培養基中，設置恒溫振蕩培養箱的溫度30℃，轉速180 r/min振蕩培養6 h，然后從中取適量菌液于血球計數板計數，至鏡檢細胞濃度為1 mL菌液含有106個酵母菌［7］。從培養基中取1 mL于1.5 mL的離心管中，以8 000 r/min的轉速在臺式高速離心機中離心10 min，用無菌水將菌體輕輕沖洗兩三次，并用振蕩器振蕩成菌懸液。

1.3.3.3紫外線照射

紫外照射誘變用波長為365 nm的紫外線進行照射，每隔20 s取1 mL照射過的菌懸液進行10倍梯度稀釋，每個梯度都要用振蕩器把菌液振蕩均勻，然后使用移液槍分別取0.1 mL的菌懸液滴在平板中，用涂布器進行涂布分離，鑒于菌體濃度達到106個/mL，涂布時涂10-4、10-5、10-63個稀釋度作為試驗的空白對照，涂10-3、10-4、10-53個稀釋度作為試驗的誘變組。誘變后，在生化培養箱中，30℃培養條件下，避光培養，36 h之后，待菌落長出，在菌落計數器下進行計數。計算不同條件下的致死率，以致死率75%～80%的照射時間作為最佳誘變條件［8］。

1.3.3.4硫酸二乙酯（DES）誘變

將菌懸液分別轉入已經加入16 mL磷酸緩沖液的50 mL錐形瓶中，接著再將體積分數為1%、2%、3%、4%、5%的DES 1 mL分別加入錐形瓶中，振蕩處理50 min后分別加入20 mL 25%硫代硫酸鈉溶液使反應停止，后續過程同紫外線照射操作方法［9］。

1.3.3.5復合誘變

將菌懸液轉入50 mL錐形瓶中，加入16 mL磷酸緩沖液，再加體積分數為4%DES 1 mL，振蕩處理25 min后加入20 mL 25%硫代硫酸鈉溶液終止反應，用提前準備好的高壓蒸汽滅菌鍋滅過菌的培養皿平板，使用移液槍取5 mL的上述經過DES處理過的菌懸液于此平板中，將平皿放在臺式暗箱紫外分析儀中，取下平皿蓋，用波長為365 nm的紫外線進行照射，二者相距30 cm，照射60 s，后續過程同1.3.3.3［10］。

1.3.4篩選方法

初篩：試驗所用樣品經過上述物理誘變、化學誘變和復合誘變3種不同方式的誘變之后，在液體培養基中進行接種，環境為30℃，180 r/min搖床內進行振蕩培養6 h，計數菌體數量級為106個/mL，用移液槍精確吸取菌液1 mL，對其進行離心，在一系列的梯度稀釋后，在含有不同濃度Cr3+的經過篩選的培養皿平板上，吸取0.1 mL的菌液進行接種。其濃度分別是600、700、800、900、1 000 μg/mL。每個稀釋梯度分別用涂布器涂布3～5個培養皿平板。涂好平板后，在生化培養箱中，30℃培養條件下，24 h之后，待菌落長的明顯后，挑選長勢較好菌落明顯的菌，即能在較高Cr3+平板上生長的菌株，傳代兩次。在冰箱中進行菌種低溫保藏，以便后期復篩使用［11］。

復篩：將初篩低溫保藏的菌株分別取一環接入三角燒瓶中，三角瓶裝100 mL的發酵培養基，設置溫度為30℃，轉速為210 r/min，在生化培養箱中培養1 d，待培養結束后的菌液離心、干燥測其生物量，測其鉻含量。同時，將原菌株在同樣條件下進行發酵，用以比較各誘變菌株與原始菌株生物量和鉻含量［12］。

1.3.5鉻標準曲線的測定

精確吸取標準鉻使用液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別加2 mL2%的鹽酸，定容到100 mL。用原子吸收分光光度計進行測試，在計算機上設置測試條件為：燈電流I=3 mA，狹縫=0.4 nm，波長=357.9 nm，燃燒器高度=8 mm，空氣流量=7 L/min，乙炔氣流量=2.5 L/min，空氣壓力=0.3 MPa，乙炔壓力=0.09 MPa，用測定的吸光度值，得出鉻的標準曲線。

鉻標準使用液：配制濃度為為100 μg/mL Cr3+的溶液。

1.3.6總鉻的初步測定

在接種之前，分別從20瓶配制好液體培養基中取出10 mL培養基于20支15 mL離心管中，作為對照組，以上述震蕩培養條件為準，待菌搖床培養24 h后，重復初篩的操作步驟，3 000 r/min，20min進行離心，取出上清液放入試管內，作為試驗所需要的樣品。測定吸光度，在計算機上設置測試條件為：燈電流I=3 mA，狹縫=0.4 nm，波長=357.9 nm，燃燒器高度=8 mm，空氣流量=7 L/min，乙炔氣流量=2.5 L/min，空氣壓力= 0.3 MPa，乙炔壓力=0.09 MPa，火焰類型：還原性黃色焰。測定接種前和接種后上清液的吸光度A和B，則A-B是初步測定的酵母吸收的鉻含量。

1.3.7生物量的測定

取45 mL試驗所得的菌液放入離心管中，轉速為3 000 r/min，離心12 min，加入適量超純水振蕩，使富鉻酵母沒有沉淀，再次離心。此步驟反復兩次，收集沉淀物，在60℃烘箱中烘24 h后稱重，推斷出100 mL菌液的生物量，即富鉻酵母所測生物量［12］。

1.3.8總鉻的測定

在研缽中，放入試驗所得到的富鉻酵母，進行研磨，得到富鉻酵母粉。稱取0.1 g～0.2 g鉻酵母加碳酸鈉進行加熱，蒸干其中水分，調低溫度將其中的水慢慢蒸發至只有固體的灰分，在600℃馬弗爐中進行對試驗所得的灰分進行灰化6 h后，出現白色或淡黃色的固體，一段時間后至冷卻，使用蒸餾水沖洗馬弗爐，待沖洗干凈后，將沖洗液體倒入50 mL的標準容量瓶中并定容，測得吸光度值，根據標準曲線計算鉻含量。

2　結果與分析

2.1酵母菌的生長曲線

酵母菌生長曲線見圖1。

圖1　酵母菌生長曲線Fig.1Yeast growth curve

從圖1的酵母生長曲線可以看出，該菌在6 h生長速率最快，達到對數期，這時的菌最敏感，取這個時期的菌進行誘變，24 h達到穩定期。

2.2紫外照射的致死率

酵母菌紫外致死曲線見圖2。

圖2　酵母菌紫外致死曲線Fig.2Yeast UV lethal curve

從圖2中的酵母菌紫外致死曲線可以看出，照射時間不斷延長，致死率不斷提高，當照射時間為100 s時，致死率達到80%，因此確定100 s為最佳誘變時間。從100 s后，致死率趨于平緩，達到90%。

2.3DES誘變的致死率

酵母菌化學誘變致死曲線見圖3。

圖3　酵母菌化學誘變致死曲線Fig.3Yeast chemical mutagenesis lethal curve

從圖3中可以看出，隨著化學劑量的增大，致死率越來越高，當DES劑量為4%時的致死率為80%，4%為最佳劑量。同時篩出5株長得好的菌株，分別為H1、H2、H3、H4、H5。

2.4復合誘變

經4%DES化學誘變后，再經紫外誘變60 s，在篩選培養基上900 μg/mL鉻濃度菌長得最好，在鉻濃度為1 000 μg/mL情況下，培養皿中長出的菌較小，因此將900 μg/mL鉻濃度確定為復篩時最佳的鉻添加量。將復合誘變后的菌株篩出10株，分別為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10。

2.5鉻標準曲線

鉻的標準曲線見圖4。

圖4　鉻的標準曲線Fig.4Standard curve of chromium

2.6對鉻富集能力強的菌株進行篩選

對鉻富集能力強的菌株進行篩選見表1。

從表1中可以得知，富鉻能力強的菌株有F1，F2，F6，F9，Z1 5株，其中F9菌株鉻含量達13.4 mg/g。

3　結論

本課題組確定取培養6 h即處于對數時期的菌進行誘變，單因素誘變過程中確定紫外線最佳誘變劑量為100 s。DES最佳誘變劑量為4%。經過單一誘變和復合誘變的菌株進行第二次篩選，選出鉻含量高的菌株F1、F2、F6、F9、Z1，其中F9的鉻含量最高，達到13.4 mg/g，比誘變前提高了2.74倍。

表1　篩選富集鉻的菌株Table 1Screening enriched chromium strong strain

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Mutation of Chromium-rich Yeast and Isolation of Mutants

HU Feng-lan，HE Ying，ZHAO Jian-ying
（Department of Life Science，Lvliang College，Lvliang 033000，Shanxi，China）

This research mainly through three mutagenesis ways to mutagenesis of yeast，the mutagenic methods including ultraviolet irradiation，chemical mutagenesis and compound mutagenesis，and filter out high-yield strains of resistant chromium.The results showed that：through ultraviolet mutagenesis，when mutagenesis time of 100 s，the fatality rate was 80%，so100 s was the best mutation time，and five strains（Z1，Z2，Z3，Z4，Z5）were screened；mutagenic yeast by different concentrations of DES（硫酸二乙酯），best lethal dose was the volume fraction 4%of DES，at the same time，during the process of yeast mutagenesis，five strains were isolated and screened out.When yeast compound mutation，bacteria samples treated with 4%of DES，the processing time was 25 min，and then irradiated with ultraviolet bacterial suspension 60 s，good-growing ten strains（F1，F2，F3，F4，F5，F6，F7，F8，F9，F10）were screened；screening of strains again aftering a single mutation and composite mutagenesis，selected chromium-rich strains F1，F2 and F6，F9，Z1，which the F9 chromium content was the highest，reached 13.4 mg/g.

chromium；yeast；mutation；screening

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.035

2016-03-03

呂梁學院科研基金項目資助（ZRQN201403）；山西省大學生創新創業項目（2015456）；呂梁學院大學生創新創業項目（CXCYZD201503）

呼鳳蘭（1980—）女（漢），講師，碩士，研究方向：生物學。