響應面優化甲烷氧化菌素、苯甲酸鈉和山梨酸鉀復配劑抑菌效果

邢海麗，辛嘉英*，王　艷，高圣博

（哈爾濱商業大學 食品科學與工程省級重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

響應面優化甲烷氧化菌素、苯甲酸鈉和山梨酸鉀復配劑抑菌效果

邢海麗，辛嘉英*，王艷，高圣博

（哈爾濱商業大學 食品科學與工程省級重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

在單因素試驗的基礎上，利用響應面試驗研究甲烷氧化菌素、苯甲酸鈉和山梨酸鉀復配劑對白色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響，模擬得出了抑菌圈直徑的回歸方程，利用Design-Expert軟件分析表明：當甲烷氧化菌素-苯甲酸鈉-山梨酸鉀質量濃度最佳配比為0.330∶0.309∶0.144時，最大抑菌圈直徑的理論值為34.99 mm，實際值為34.7 mm，此時最佳復配劑對白色葡萄球菌最小抑菌濃度為0.05 mg/mL。

甲烷氧化菌素；化學防腐劑；復配劑；抑菌效果；響應面

近些年來，食品添加劑已用于調味、著色、延長食品的保質期以及食品安全宣傳［1］，是食品加工生產中不可缺少的一部分［2-3］。隨著人民生活水平的提高，綠色食品、健康食品的概念深入人心，天然食品防腐劑更加受到人們的重視，并成為食品添加劑研究和應用的一個熱點［4-5］。甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb）是由甲烷氧化細菌分泌的，它既能夠以分泌物的形式存在于細胞外，又能以顆粒型甲烷的加氧酶組成結構成分存在于細胞內膜上，是一種小分子的熒光肽，對銅具有較強的親和性［6-8］。而甲烷氧化菌是參與全球碳循環的一個重要微生物［9-10］，也由于其生長快、易培養，易大規模工業化生產、不受季節與自然條件限制等優越性，已經被用于生產單細胞蛋白及蝦青素等［11］，因此利用微生物生產天然抗菌劑的技術具有很好的應用前景［12-14］。

國內外研究表明，由于很多食品添加劑在功能和應用方面具有局限性，將幾種來源不同的天然食品防腐劑復配，或者將一種天然防腐劑與其他化學防腐劑復配使用，不僅可以減少防腐劑在食品中的用量，同時還可以使食品的殺菌或抑菌條件更加溫和化，達到互補或協同增效作用［15-16］，對人們的飲食健康非常有利。苯甲酸鈉和山梨酸鉀因其價格低廉，又具有廣譜的抑菌效果，廣泛應用于食品中［17-18］，這兩種化學防腐劑小劑量的攝入對人體并無大礙，但是大劑量的攝入對身體有一定的危害［19-21］。因此，本實驗使用天然微生物源的食品防腐劑Mb和苯甲酸鈉、山梨酸鉀進行復配，在單因素試驗的基礎上，利用響應面試驗法對復配劑進行優化，以指示菌的抑菌圈直徑為響應值，獲得最佳的復配比例，以及在最佳復配比例條件下的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），減少了化學防腐劑的用量，復配防腐劑應用于食品中更安全。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

甲烷氧化菌IMV3011（Methylosinus trichosporium IMV 3011），由俄羅斯科學院催化研究所提供；白色葡萄球菌，由哈爾濱商業大學食品工程學院微生物實驗室提供。

細菌培養基：由蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉和瓊脂組成。

Diaion HP-20大孔吸附樹脂、1.1 cm×20 cm層析柱 日本三菱化工公司；苯甲酸鈉、山梨酸鉀（均為食品級） 豐達食品添加劑有限公司。

1.2儀器與設備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械公司；5BG-生化發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；RV8V旋轉蒸發儀 德國IKA公司；FDU-1200冷凍干燥機 東京理化器械公司；HDL潔凈工作臺北京東聯哈爾儀器公司；電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1Mb的提取純化

將30 ℃培養3 d的甲基彎菌IMV 3011發酵液置于4 ℃、8 000 r/min冷凍離心機中離心20 min除去菌體，取上清液，在上清液中加入適量的CuSO4溶液，常溫條件下靜止2 h，上清液通過已活化的Diaion HP-20大孔樹脂進行吸附，吸附過程結束后，對吸附有Mb的大孔樹脂進行除鹽操作，除鹽后使用60%乙醇溶液作為洗脫液進行脫附操作，收集洗脫液通過旋轉蒸發（40 ℃、250 r/min）初步出去乙醇，然后預冷凍后通過冷凍干燥機除去水分，凍干后的Mb-Cu粗品置于-30 ℃冰箱中儲存備用［22］。

1.3.2單因素MIC的測定

將Mb-Cu、苯甲酸鈉、山梨酸鉀用2倍稀釋法［23］稀釋得到各種質量濃度，然后再將帶有指示菌的斜面中加入已滅菌的液體培養基，調整菌濃，使每毫升液體培養基中含活菌數達 1×106CFU/mL。以不加Mb-Cu、苯甲酸鈉、山梨酸鉀但接菌的試管作為陽性對照，以不加Mb-Cu、苯甲酸鈉、山梨酸鉀且不接種菌的試管作為陰性對照，同時，以不加Mb-Cu加入與Mb-Cu等質量濃度的Cu2+接菌的試管作對照。采用平板傾注法，依次將未見菌生長的各管培養物各吸取0.1 mL注入無菌平板培養基中，37 ℃培養24 h，實驗組無菌生長組所對應的Mb-Cu、苯甲酸鈉、山梨酸鉀的最低質量濃度，為MIC。

1.3.3單因素試驗設計

采用濾紙片擴散法［24］，先制備直徑20 mm濾紙圓片，121 ℃高壓滅菌20 min，自然晾干備用。制備營養瓊脂平板，吸取濃度為1×106CFU/mL的菌懸液100 μL置平板表面，用玻璃三角涂棒涂勻，將濾紙片浸泡于防腐液中1 min，取出晾微干，輕貼于平板上，每一個平皿均勻放2 張濾紙片，設1 個空白對照。每種防腐液做3 個平板重復，37 ℃培養24 h后用游標卡尺測量各抑菌圈直徑，抑菌圈直徑取平均值。抑菌圈直徑大于20 mm為有抑菌作用，不大于20 mm為無抑菌作用，對照組應無抑菌圈產生，實驗有效。

固定苯甲酸鈉質量濃度0.600 mg/mL、山梨酸鉀質量濃度0.335 mg/mL，探討Mb-Cu質量濃度對白色葡萄球菌抑菌圈直徑大小的影響；固定Mb-Cu質量濃度2.540 mg/mL、山梨酸鉀質量濃度0.335 mg/mL，探討苯甲酸鈉質量濃度對白色葡萄球菌抑菌圈直徑大小的影響；固定Mb-Cu質量濃度2.540 mg/mL、苯甲酸鈉質量濃度0.600 mg/mL，探討山梨酸鉀質量濃度對白色葡萄球菌抑菌圈直徑大小的影響。

1.3.4響應面試驗設計

在單因素試驗結果基礎上，綜合考慮各因素對指示菌抑菌圈直徑的影響，采用Box-Behnken設計方案，三因素Mb質量濃度、苯甲酸鈉質量濃度、山梨酸鉀質量濃度分別用X1、X2、X3表示，每一自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼，該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程可以表達為：

式中：Y為響應值（抑菌圈直徑）；A0、Ai、Aii、Aij為方程系數；Xi、Xj（i≠j）為自變量編碼值，確定最優防腐劑方案配比，并使用1.3.2節的方法確定最優防腐劑配比下的MIC。因子編碼及各自變量水平見表1。

表1　響應面試驗設計因素與水平Table1　Factors and their coded levels used for Box-Behnken design mg/mL

2　結果與分析

2.1單因素的MIC

表2　單因素的MICTable2　Minimum inhibitory concentrations of single preservatives mg/mL

由表2可知，Mb-Cu、苯甲酸鈉和山梨酸鉀對白色葡萄球菌的MIC值分別為2.540、0.150、1.340 mg/mL。結果表明，Mb-Cu可以有效地抑制白色葡萄球菌的生長。

2.2單因素試驗結果

圖1　Mb（A）、苯甲酸鈉（B）、山梨酸鉀（C）質量濃度對白色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響Fig.1　Effects of concentrations of methanobactin-Cu2+， sodium benzoate and potassium sorbate on inhibition zone diameters against Staphylococcus albus

由圖1可以看出，白色葡萄球菌的抑菌圈直徑隨著Mb、苯甲酸鈉和山梨酸鉀質量濃度的增加而增加，根據GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》和GB 2760—2014A.2食品添加劑的使用規定中，同一功能的食品添加劑（相同色澤著色劑、防腐劑、抗氧化劑）在混合使用時，各自用量占其最大使用量的比例之和不應超過1，綜合考慮選定Mb質量濃度的3 個水平為：2.54、3.81、5.08 mg/mL；苯甲酸鈉質量濃度為0.30、0.45、0.60 mg/mL；山梨酸鉀質量濃度為0.167、0.251、0.335 mg/mL。

2.3響應面試驗優化結果

2.3.1響應面試驗結果

表3為采用Box-Behnken設計方案所得試驗結果。

表3　Box-Behnken試驗設計及結果Table3　Box-Behnken design with experimental results of inhibition zone diameter

2.3.2建立模型方程與顯著性檢驗

利用Design-Expert軟件對表3中的數據進行多元回歸擬合及顯著性檢驗，結果如表4所示。

表4　回歸方程系數及其顯著性檢驗Table4　Regression coefficients and significance test of regression model

Mb質量濃度（X1）、苯甲酸鈉質量濃度（X2）和山梨酸鉀質量濃度（X3）與抑菌圈直徑之間的二次多項回歸方程為：

回歸方差分析顯著性檢驗表明，Mb質量濃度、苯甲酸鈉質量濃度和山梨酸鉀質量濃度3個因素對白色葡萄球菌抑菌圈直徑的線性效應都很顯著（P＜0.000 1＜0.01）；各因子間交互作用很顯著（P＜0.01）。在本試驗設計范圍內，F=1 635.85，P＜0.000 1＜0.01，說明該模型極其顯著。該模型的校正決定系數R2Adj為0.998 9，表明99.89%的抑菌圈直徑變異在所研究的3 個因素中，其中總變異中僅有0.11%不能由該模型解釋，因此該模型擬合程度較好，試驗誤差小。變異系數表明不同水平處理組之間的變異程度，變異系數為0.45%，說明該模型重復性較好，證明應用響應面法優化Mb質量濃度、苯甲酸鈉質量濃度和山梨酸鉀質量濃度對白色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響是可行的。

2.3.3響應面分析及復配劑優化

通過模型方程所作的響應面圖及其等高線，如圖2所示。

由圖2可知，Mb和苯甲酸鈉、Mb和山梨酸鉀交互作用顯著，等高線的形狀可反映出交互效應的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反［25］。通過軟件最后結果分析，得到的抑制白色葡萄球菌的最佳復配比例為：Mb-苯甲酸鈉-山梨酸鉀質量濃度比為0.330∶0.309∶0.144。此時對白色葡萄球菌的抑菌圈直徑做出的理論分析值為34.99 mm。同時驗證回歸方程和實際結果擬合程度，在此條件下進行5 次驗證實驗，最后得到的實際平均抑菌圈直徑為34.7 mm，與理論值基本上吻合，具有良好的重復性，因此，采用此響應面法所得到的抑菌參數比較準確可靠，具有實際應用價值。并使用1.3.2節的方法確定最優防腐劑配比條件下的MIC為0.05 mg/mL。

3　結 論

Mb是一種新型的潛在的微生物源的食品防腐劑，本實驗主要研究了其與食品中常用的化學防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀復配對白色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響。測定單獨用Mb、苯甲酸鈉和山梨酸鉀對白色葡萄球菌的MIC分別為2.540、0.150、1.340 mg/mL。將Mb、苯甲酸鈉、山梨酸鉀三因素進行復配，在單因素分析的基礎上，用響應面法優化其復配比例，通過抑菌實驗測定抑菌圈直徑大小作為響應值，最后由軟件分析法得出各個菌的最佳復配比例為Mb-苯甲酸鈉-山梨酸鉀質量濃度比為0.330∶0.309∶0.144，最大抑菌圈直徑的理論值為34.99 mm，實測值為34.7 mm。MIC值為0.05 mg/mL，三因素復配的MIC值遠低于單因素的MIC值，這說明復配劑之間的協同作用能提高其抑菌作用。

［1］ 王常柱， 武杰， 高曉宇. 食品添加劑的歷史、現實與未來［J］. 中國食品添加劑， 2014（1）: 61-67.

［2］ SHIM S M， SEO S H， LEE Y， et al. Consumers’ knowledge and safety perceptions of food additives: evaluation on the effectiveness of transmitting information on preservatives［J］. Food Control， 2011， 22: 1054-1060. DOI:10.1016/j.foodcont.2011.01.001.

［3］ 王靜， 孫寶國. 食品添加劑與食品安全［J］. 科學通報， 2013， 58（26）: 2619-2625. DOI:10.1360/972012-1635.

［4］ AYALA-ZAVALA J F， VEGA-VEGA V， ROSAS-DOMINGUEZ C， et al. Agro-industrial potential of exotic fruit byproducts as a source of food additives［J］. Food Research International， 2011， 44: 1866-1874. DOI:10.1016/j.foodres.2011.02.021.

［5］ SILVIA A V， LLUIS P， MIGUEL á R， et al. Performance of hydroxypropyl methylcellulose （HPMC）-lipid edible coatings with antifungal food additives during cold storage of “Clemenules”mandarins［J］. LWT-Food Science Technology， 2011， 44: 2342-2348. DOI:10.1016/j.lwt.2011.02.014.

［6］ XIN Jiaying， CHEN Dandan， ZHANG Lanxuan， et al. Methanobactinmediated one-step synthesis of gold nanoparticles［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2014， 14（11）: 21676-21688. DOI:10.3390/ijms141121676.

［7］ XIN Jiaying， LIN Kai， WANG Yan， et al. Improved biological synthesis of gold nanoparticles using methanobactin［J］. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry， 2015， 58（3）: 387-395. DOI:10.1007/s13765-015-0057-3.

［8］ 周琦瓊， 辛嘉英， 張穎鑫， 等. 甲烷氧化菌素的生物活性研究進展［J］. 生物技術通訊， 2009， 20（5）: 723-725. DOI:10.3969/ j.issn.1009-0002.2009.05.035.

［9］ XIN Jiaying， ZHANG Yingxin， DONG Jing， et al. Epoxypropane biosynthesis by whole cell suspension of methanol-growth Methylosinus trichosporium IMV 3011［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2010， 26: 701-708. DOI:10.1007/ s11274-009-0225-x.

［10］ XIN Jiaying， ZHANG Lanxuan， CHEN Dandan， et al. Colorimetric detection of melamine based on methanobactin-mediated synthesis of gold nanoparticles［J］. Food Chemistry， 2015， 174: 473-479. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.11.098.

［11］ JOHNSON C L. Methanobactin: a potential novel biopreservative for use against the foodborne pathogen Listeria monocytogenes［D］. Ames: Iowa State University， 2006: 85-86.

［12］ 王歲樓， 張平之. SOD在食品中的應用及微生物SOD的開發［J］. 山西食品工業， 1998（3）: 1-2.

［13］ 王歲樓， 張平之. 微生物SOD的提純、育種及分子生物學研究［J］.微生物學雜志， 1996， 16（4）: 6-11.

［14］ 邢海麗， 辛嘉英， 王艷， 等. 微生物源天然食品防腐劑的研究進展［J］.食品安全質量檢測學報， 2015， 6（10）: 3889-3894.

［15］ BEATRIZ R B， SAENZ Y， MYRIAM Z， et al. Antimicrobial activity of nisin against Oenococcus oeni and other wine bacteria［J］. International Journal of Food Microbiology， 2007， 116（1）: 32-36. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2006.12.020.

［16］ SMILANICK J L， MANSOURA M F， GABLERB F M， et al. Control of citrus postharvest green mold and sour rot by potassium sorbate combined with heat and fungicides［J］. Postharvest Biology and Technology， 2008， 47（2）: 226-238. DOI:10.1016/ j.postharvbio.2007.06.020.

［17］ 石立三， 吳清平， 吳慧清， 等. 我國食品防腐劑應用狀況及未來發展趨勢［J］. 食品研究與開發， 2008， 29（3）: 157-161.

［18］ 王思文， 鞏江， 高昂， 等. 防腐劑苯甲酸鈉的藥理及毒理學研究［J］.安徽農業科學， 2010， 38（30）: 16724-16846. DOI:10.13989/ j.cnki.0517-6611.2010.30.189.

［19］ 肖燕清， 白衛東， 錢敏. 我國食品防腐劑的發展現狀與對策［J］. 中國調味品， 2010， 35（11）: 43-45.

［20］ 郭松年， 田淑梅， 白洪濤. 乳酸菌及乳酸菌發酵食品［J］. 食品科學，2005， 26（1）: 39-40.

［21］ 王燕， 車振明. 食品防腐劑的研究進展［J］. 食品研究與開發， 2005，26（5）: 167-170.

［22］ CHOI D W， ANTHOLINE W E， DO Y S， et al. Effect of methanobactin on the activity and electron paramagnetic resonance spectra of the membrane-associated methane monooxygenase in Methylococcus capsulatus Bath［J］. Microbiology， 2005， 151（10）: 3417-3426. DOI:10.1099/mic.0.28169-0.

［23］ 呂淑霞， 白澤樸， 代義， 等. 乳酸鏈球菌素（Nisin）抑菌作用以及抑菌機理的研究［J］. 中國釀造， 2008， 27（9）: 87-91.

［24］ 程麗娟， 唐明， 袁靜， 等. 微生物學實驗技術［M］. 北京: 科學技術出版社， 1993: 54.

［25］ 徐媛， 王魯峰， 徐曉云， 等. 響應曲面法優化紅葡萄柚番茄紅素的提取工藝［J］. 食品科學， 2010， 31（22）: 255-259.

Optimization of Combinations of Methanobactin， Sodium Benzoate and Potassium Sorbate for Enhanced Antibacterial Effect by Response Surface Methodology

XING Haili， XIN Jiaying*， WANG Yan， GAO Shengbo
（Key Laboratory for Food Science and Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin 150076， China）

One-factor-at-a-time method and response surface methodology were applied jointly to study the individual and combined effects of methanobactin， sodium benzoate and potassium sorbate on inhibition zone diameters against Staphylococcus albus. As a result， a regression model was developed using inhibition zone diameter as response variable. The analysis carried out using Design-Expert software showed that the maximum inhibition zone diameter of 34.99 mm was obtained by the combined use of methanobactin， sodium benzoate and potassium sorbate at a mass ratio of 0.330:0.309:0.144，representing a minimum inhibitory concentration against S. albus of 0.05 mg/mL.

methanobactin； chemical preservative； blends； antimicrobial effect； response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201618001

TS202.3

A

1002-6630（2016）18-0001-05

邢海麗， 辛嘉英， 王艷， 等. 響應面優化甲烷氧化菌素、苯甲酸鈉和山梨酸鉀復配劑抑菌效果［J］. 食品科學， 2016，37（18）: 1-5. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618001. http://www.spkx.net.cn

XING Haili， XIN Jiaying， WANG Yan， et al. Optimization of combinations of methanobactin， sodium benzoate and potassium sorbate for enhanced antibacterial effect by response surface methodology［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 1-5. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618001. http://www.spkx.net.cn

2015-12-11

國家自然科學基金面上項目（21573055）

邢海麗（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學。E-mail：841084208@qq.com

辛嘉英（1966—），男，教授，博士，研究方向為生物催化。E-mail：xinjiayingvip@163.com