高效液相色譜法測定雞蛋中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮殘留量

朱麗萍，王建萍，丁雪梅，曾秋鳳，白世平，玄　玥，宿卓薇，張克英*

（四川農業大學動物營養研究所，動物抗病營養教育部重點實驗室，四川 成都 611130）

高效液相色譜法測定雞蛋中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮殘留量

朱麗萍，王建萍，丁雪梅，曾秋鳳，白世平，玄玥，宿卓薇，張克英*

（四川農業大學動物營養研究所，動物抗病營養教育部重點實驗室，四川 成都 611130）

建立一種用于測定雞蛋粉中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮（5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione，5-VOT）殘留量的高效液相色譜法，并探討5-VOT在雞蛋中的殘留消除情況。選用450 只30 周齡的羅曼粉殼蛋雞，隨機分為3 組，分別飼喂含0%（對照組，處理1）、17.64%（處理2）、29.4%（處理3）菜粕的飼糧，飼喂12 周后各組均換飼對照組的飼糧4 周，實驗期共16 周。實驗采用乙腈提取雞蛋粉中5-VOT，樣品經超聲、離心、旋轉蒸干處理，用pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液復溶，下層溶液離心后經0.45 μm無機濾膜過濾上機。結果表明，方法平均加標回收率在81.28%～103.28%之間，平均回收率、重復性及精密度的相對標準偏差分別為0.75%～5.17%、2.19%、0.82%，可滿足雞蛋中5-VOT殘留量的測定；雞蛋中5-VOT殘留量隨著蛋雞飼糧中菜粕含量以及蛋雞飼喂菜粕飼糧時間的延長而增加，處理組3菜粨飼喂12 周后5-VOT殘留量高達1 837.45 ng/g；換飼對照組飼糧4 周后，雞蛋中未檢出5-VOT。

高效液相色譜法；雞蛋；5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮

菜粕是十字花科植物油菜籽榨油后的副產物，是重要的蛋白質飼料來源之一［1］，菜粕因其含有豐富的蛋白質和平衡的氨基酸組成［2］，同時含有比豆粕更豐富的礦物元素如鈣、磷、鐵、錳、鋅、銅等［3］，被應用于畜禽飼糧中［4-6］。然而菜粕中含有大量的抗營養因子，主要包括硫葡萄糖苷及其代謝產物，硫葡萄糖苷本身對動物沒有毒性［7］，但其代謝產物如噁唑烷硫酮、硫氰酸鹽、異硫氰酸酯等會導致動物體肝臟、腎臟、甲狀腺等受損傷、抑制動物的生長［8］，限制了其在畜禽飼料中的應用［9］。菜籽中的硫葡萄糖苷種類較多，但最主要有兩種，包括3-丁烯基硫葡萄糖苷和2-羥基-3-丁烯基硫葡萄糖苷，前者水解主要產生3-丁烯基異硫氰酸酯，后者水解主要產生5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮（5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione，5-VOT）［10］。5-VOT和硫氰酸鹽是造成甲狀腺腫大及功能減退的最主要的物質［11］，其中5-VOT造成甲狀腺功能減退的活力相當于丙硫氧嘧啶的133%［12］。研究表明，給大鼠腹腔注射1 μg 5-VOT會抑制甲狀腺激素的合成，而注射5 μg即會引起甲狀腺腫大［13］；長期給大鼠飼喂含50～100 ng/mL 5-VOT的牛奶，同樣會引起甲狀腺的腫大［14］。當長期給畜禽飼喂含菜粕的飼料時，這些毒素也會蓄積到動物體組織和產品中，如牛奶、肌肉和雞蛋，對人體健康造成一定的威脅［15］。

歐盟等國家及我國僅對畜禽飼料中噁唑烷硫酮及異硫氰酸酯的含量進行了限量規定，同時也建立了相應的檢測方法和標準。國際標準化組織建立的標準方法ISO 5504—1992《油料種子殘渣：全部異硫氰酸鹽和乙烯基硫代惡唑烷酮含量的測量》是許多國家的官方檢測標準，噁唑烷硫酮的測定采用紫外分光光度法，但已于1998年9月17日廢除［16］，目前尚未有新標準。我國GB/T 13089—1991《飼料中噁唑烷硫酮的測定方法》［17］和NY/T 1799—2009《菜籽餅粕及其飼料中噁唑烷硫酮的測定：紫外分光光度法》［18］采用紫外分光光度法測定飼料中噁唑烷硫酮，紫外分光光度法相比于高效液相色譜法靈敏度低、檢出限高。

有關食品中5-VOT殘留量的測定尚無相關標準，僅有極少的研究報道用氣相色譜法測定血清、尿液、牛奶中5-VOT含量［19］，用高效液相色譜法測定羊體組織中5-VOT含量［20］，以及分光光度法測定魚肉中噁唑烷硫酮［21］，而雞蛋中5-VOT殘留量測定方法的研究鮮見報道。

因此，本實驗選用高效液相色譜儀，擬建立一種快速、精準、可靠的測定雞蛋中5-VOT殘留量的方法；同時用本方法測定大量雞蛋樣品中5-VOT殘留量，探討5-VOT在雞蛋中的殘留和消除變化情況，為評定雞蛋的安全食用提供數據支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

菜粕（菜籽預壓浸提榨油后的副產物） 四川新興糧油廠；450 只30 周齡的羅曼粉殼蛋雞 市購。

超純水（Mini-Q超純水）、Na3PO4（分析純）、H3PO4（分析純） 成都市科龍化工試劑廠；5-VOT標準品（98%，色譜純） 阿法埃莎（中國）化學有限公司；乙腈、正己烷（均為色譜純） 美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

1200高效液相色譜儀（配備G1314F 1260VWD紫外檢測器） 美國Agilent Technologies公司；Heto PowerDry PL6000凍干機 美國Thermo Scientific公司；離心機 美國Eppendorf公司；MX-F漩渦混勻儀漩渦儀美國Scilogex公司。

1.3方法

1.3.1實驗分組及雞蛋樣品采集

實驗采用單因子完全隨機設計，設3 個處理，對照組（不添加菜粕）、60%和100%菜粕組（等氮替代豆粕），即飼糧菜粕水平分別為0%、17.64%、29.4%。參考Leoni等［22］測定飼糧中5-VOT的含量，分別為0、73.99、84.82 μg/g。

選取450 只30 周齡的羅曼粉殼蛋雞，每個處理10 個重復，每個重復15 只雞。實驗全期為16 周，前12 周分別飼喂各處理飼糧，13 周起各組均飼喂基礎組飼糧，飼喂4 周。在實驗第4、9、12、16 周結束時，各重復采集2 枚雞蛋，將蛋黃和蛋清混勻后放于樣品袋中，存于-20 ℃條件。雞蛋冷凍干燥至絕干，粉碎過40 目篩，-20 ℃保存，備用。

1.3.2標準曲線的制作

用分析天平（精度0.01 mg）精確稱取3.19 mg 5-VOT至50 mL容量瓶中，加入乙腈定容至50 mL，超聲波超30 min（100 W）至標準品溶解，配制成63.8 μg/mL的標準品溶液，儲存至4 ℃，以備稀釋用。

分別取63.8 μg/mL的5-VOT標準品溶液2 000、1 000、100、10、1 μL于10 mL的容量瓶中，加入色譜純乙腈定容至10 mL，配制成6.3、63.8、638、6 380、12 760 ng/mL的標準品溶液，240 nm波長色譜條件下檢測，記錄結果并繪制標準曲線。

1.3.3加標回收率實驗

準確稱取5-VOT含量為269.06、447.33、602.56、1 487.51 ng/g的雞蛋粉各3 份，共4 組，在各組雞蛋樣中分別添加0.15、0.20、0.27、0.50 mL質量濃度為6 380 ng/mL的5-VOT標準品溶液，測定5-VOT含量，計算加標回收率。

1.3.4雞蛋樣前處理

用分析天平準確稱取19.0 g磷酸鈉于1 000 mL容量瓶中，用超純水定容至1 000 mL，搖勻，后倒出至燒杯中，用膠頭滴管吸取少量磷酸溶液，將磷酸鹽溶液的pH值調至7.00，即0.05 mol/L、pH 7.00磷酸鈉緩沖溶液。

準確稱取雞蛋粉3.0～5.0 g粉樣于50 mL離心管中（精確到0.000 1 g），參考Leoni等［22］的方法，加入15 mL乙腈萃取目標化合物，蓋上蓋子，漩渦混勻，超聲波超聲處理15 min，10 000 r/min離心5 min，將上清液倒入雞心瓶中，重復此操作2 次，用旋轉蒸發儀蒸干，后加入2 mL的pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液、2 mL正己烷，超聲儀超聲1～2 min，保證目標物充分溶解，取下層水溶液至2 mL的離心管中，12 000 r/min離心5 min，下層清液經0.45 μm無機濾膜過濾至2 mL的進樣瓶中，儲存于4 ℃中備測。

1.3.5色譜條件［13］

色譜柱為安捷倫1200系列C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A相與B相分別為純水、乙腈（體積比為85∶15，等度洗脫），洗脫溶液為10%異丙醇溶液，柱溫30 ℃，波長240 nm，流速1.0 mL/min，時間12 min，進樣體積10 μL。

1.4統計分析

數據采用SAS 9.0進行ANOVA分析，以P＜0.05作為差異顯著性的判斷標準，差異顯著者采用LSD法進行多重比較，同時采用GLM程序進行線性回歸分析。

2　結果與分析

2.1流動相及洗脫方式的選擇

圖1　5-VOT標準品（A）和雞蛋樣品（B）色譜圖Fig.1　Chromatograms of 5-VOT standard and sample

流動相的選擇參照Mabon等［20］的研究在比例上稍作調整，A相為超純水、B相為乙腈，A相與B相體積以85∶15的比例對樣品進行等度洗脫，洗脫時間12 min。結果發現，5-VOT的保留時間為9.141 min，樣品經前處理操作后雜質少、對儀器的影響小，目標化合物與其他物質的分離度好，柱效高。標準品和樣品色譜圖如圖1所示。

2.2標準曲線及檢出限

按1.3.2節步驟，得出5-VOT的標準曲線。對質量濃度y與峰面積x進行線性回歸，得到方程式y=12.183x-39.383（R2=1.000 0），在質量濃度范圍6.3～63 800 ng/mL之間線性關系好；以RSN為3計算儀器檢出限為0.224 0 ng/mL，以RSN為10計算儀器定量限為0.746 6 ng/mL。

2.3方法回收率

表1　5-VOT加標回收率（n=3）Table1　Recovery rates of 5-VOT in spiked sample （n= 3）

由表1可知，5-VOT檢測方法的回收率在81.28%～103.28%之間，回收率的相對標準偏差在0.75%～5.17%之間，可見方法的準確度高。

2.4方法重復性

選擇實驗第4周處理3的同一個重復雞蛋樣品，準確稱取6 份進行檢測，結果見表2，5-VOT含量均值為1 014.73 ng/g，相對標準偏差為2.19%，可見方法的可重復性高。

表2　5-VOT檢測方法重復性（n=6）Table2　Repeatability of the method （n = 6）

2.5儀器精密度

選擇質量濃度為63.8 mg/L的5-VOT標準品上機連續檢測6 次，記錄峰面積，結果見表3，相對標準偏差為0.82%，可見儀器的精密度高。

表2　5-VOT檢測方法重復性（n=6）Table2　Repeatability of the method （n = 6）

2.6樣品檢測結果

如表4所示，未添加菜粕組雞蛋中不含有5-VOT。在實驗第4、9、12周，隨著飼糧中5-VOT含量的增加，雞蛋中5-VOT殘留量極顯著增加（P＜0.01），呈一次線性關系（P＜0.000 1）；而隨著實驗時間的延長，處理組2雞蛋中5-VOT殘留量顯著增加（P＜0.05），呈一次線性關系（P＜0.05）；處理組3有顯著增加的趨勢（P＜0.1），各組在12 周后換飼對照組飼糧4 周后未檢出5-VOT。

表4　雞蛋樣檢測結果Table4　Results for the determination of 5-VOT in eggs

3　討 論

菜粕中的抗營養因子硫葡萄糖苷，在葡糖硫苷酶、微生物的水解作用下降解產生很多有毒物質，主要包括5-VOT和硫氰酸鹽，對動物的甲狀腺組織有很大的毒性，會造成甲狀腺的腫大及功能減退。動物采食含菜粕的飼糧后，在腸道微生物的作用下產生5-VOT，其經腸道吸收進入血液后轉移至體組織中，對人體健康造成一定的威脅。前人的研究僅是對體液包括牛奶、血漿、尿液［19］以及牛羊肌肉、血漿、肝臟、腎臟、甲狀腺［23］中的5-VOT進行了測定，而對雞蛋中5-VOT含量的測定鮮見報道。可見，測定雞蛋中5-VOT殘留量對雞蛋的安全食用評定具有很大的意義。

本實驗結果表明，采用高效液相色譜法，應用紫外檢測器能夠滿足雞蛋中5-VOT的測定需求，用乙腈萃取雞蛋中5-VOT，樣品中雜質少，對儀器的影響小，且在12 min內可以將5-VOT與其他化合物完全分離開。標準品質量濃度在6.3～63 800 ng/mL范圍之間線性關系好（R2=1.000 0），以RSN=3計算儀器檢出限為0.224 ng/mL，平均回收率在81.28%～103.28%之間，平均回收率的相對標準偏差在0.75%～5.17%之間，重復性相對標準偏差為2.19%，精密度相對標準偏差為0.82%。可見，用該法測定雞蛋中5-VOT殘留量結果可靠、準確，能滿足雞蛋中5-VOT殘留量的測定需求。

Mabon［23］對牛羊體組織中5-VOT的測定結果，發現不添加菜粕的牛羊體組織中不含有5-VOT，隨著日糧中菜粕含量的增加，體組織中的5-VOT的殘留量也逐漸增加；同時隨著飼喂菜粕日糧時間的延長，各組織中5-VOT的殘留量也逐漸的增加；可見，日糧中5-VOT的含量與體組織中該物質的殘留量有時間和劑量效應；母羊停飼菜粕1 周后血清中5-VOT被完全清除，而甲狀腺中的5-VOT在停飼3 周后完全被清除［24］。本實驗的研究結果與其相似，不添加菜粕組的雞蛋中不含有5-VOT，同時雞蛋中5-VOT殘留量隨著蛋雞飼糧中菜粕含量以及蛋雞飼喂菜粕時間的延長而增加，具有時間和劑量效應。蛋雞停飼菜粕4 周后，雞蛋中未檢出有5-VOT殘留。

4　結 論

實驗采用乙腈提取雞蛋粉中5-VOT，樣品經超聲、離心、旋轉蒸干處理，用pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液復溶，下層溶液離心后上機，方法線性好（R2=1.000 0），回收率在81.28%～103.28%之間，可重復性和精密度高，是一種測定雞蛋中5-VOT的可靠方法。

雞蛋5-VOT的含量隨著蛋雞飼糧中菜粕含量以及蛋雞飼喂菜粕飼糧時間的延長而增加，具有時間和劑量效應；蛋雞停飼菜粕4 周后，雞蛋中未檢出有5-VOT殘留。

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Analysis of 5-Vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione Residue in Eggs by HPLC

ZHU Liping， WANG Jianping， DING Xuemei， ZENG Qiufeng， BAI Shiping， XUAN Yue， SU Zhuowei， ZHANG Keying*
（Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of China， Ministry of Education， Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）

The study was conducted to establish an analytical method for measuring 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione（5-VOT） residue in eggs and to apply it on eggs from laying hens fed different levels of rapeseed meal （RSM）. A total of 450 30-week-old Lohmann pink-shelled hens were randomly assigned to 3 dietary treatments， including 0%， 17.64% and 29.4% RSM supplementation for 16 weeks （which was withdrawn during the last 4 weeks）. 5-VOT was extracted with acetonitrile，and then evaporated to dryness with a rotating evaporator under vacuum at 35 ℃. The 5-VOT was re-dissolved in 2 mL of phosphate buffer （pH 7.0） and purified with 2 mL of n-hexane. Thereafter， the aqueous solution was transferred to a 2 mL tube and centrifuged for 5 min at 12 000 r/min. The aqueous phase was passed through a 0.45 μm filter for HPLC analysis. The average recovery rates of 5-VOT ranged from 81.28% to 103.28% with relative standard deviations （RSDs） between 0.75% and 5.17%. The RSDs of repeatability and precision were 2.19% and 0.82%， respectively. The further investigation showed that 5-VOT concentrations in eggs linearly increased with the increase in either the level of dietary RSM or feeding time. After 4 weeks of RSM withdrawal， 5-VOT residue was not detected in eggs.

high performance liquid chromatography； egg； 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione

10.7506/spkx1002-6630-201618026

S859.84

A

1002-6630（2016）18-0159-05

朱麗萍， 王建萍， 丁雪梅， 等. 高效液相色譜法測定雞蛋中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮殘留量［J］. 食品科學， 2016，37（18）: 159-163. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618026. http://www.spkx.net.cn

ZHU Liping， WANG Jianping， DING Xuemei， et al. Analysis of 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione residue in eggs by HPLC［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 159-163. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618026. http://www.spkx.net.cn

2015-10-23

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD13B04）；四川省科技廳科技支撐計劃項目（2014NZ0043；2014NZ0002）

朱麗萍（1991—），女，博士研究生，研究方向為動物營養與飼料科學。E-mail：357009299@qq.com

張克英（1961—），女，教授，博士，研究方向為家禽營養。E-mail：zkeying@sicau.edu.cn