棉花GhGGPase2基因克隆、功能序列分析、原核表達及煙草的遺傳轉化

祿亞洲　尹秀　左曉宇

摘要：以棉花纖維組織為材料，根據NCBI棉花EST進行同源搜索、比對和序列拼接，經RT-PCR從陸地棉纖維組織中擴增得到L-半乳糖磷酸化酶基因（GhGGPase2）的cDNA開放閱讀框為1 335 bp，為包含445個氨基酸的蛋白質，分子質量約為49 ku。利用軟件進行蛋白質序列分析，GhGGPase2蛋白具有組氨酸三聚體（HIT）蛋白超家族的主要特性的結構域。進化樹分析的結果表明棉花GhGGPase2與獼猴桃AdGGPase在進化上親緣關系上較近。構建原核表達載體pET28a-GhGGPase2并轉化大腸桿菌，將重組載體pET28a-GhGGPase2導入大腸桿菌BL21（DE3）中通過IPTG誘導表達后經過SDS-PAGE分析，顯示成功獲得分子質量為49 ku左右的誘導表達蛋白GhGGPase2。將GhGGPase2基因構建到植物真核表達載體pCAMBIA2300中，利用農桿菌通過葉盤法轉化煙草，經PCR分子鑒定，獲得了含GhGGPase2轉基因煙草植株。研究結果將為進一步闡明該基因的生物學功能奠定基礎。

關鍵詞：棉花纖維；L-半乳糖磷酸化酶基因；原核表達；克隆；遺傳轉化

中圖分類號： S562.032 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0026-05

棉花是全球重要的經濟作物，也是我國重要的農產品及紡織原料，是國民經濟的支柱產業之一，具有極其重要的戰略地位[1]。棉花纖維品質中最重要的參考指標是纖維的強度和長度，而細胞的伸長或膨大發育與纖維的最終品質密切相關[2]。抗壞血酸是廣泛存在于植物組織中的一種抗氧化小分子物質，尤其是在細胞分裂旺盛的植物組織中含量較高，不僅對植物生長發育、防衛、分化等許多生理過程起重要作用，還與細胞伸長密切相關[3-5]。棉花纖維細胞的結構是長而不分支的單細胞，是研究細胞生長發育與分化的理想材料。之前的研究表明：抗壞血酸代謝可能參與纖維的發育過程[6]。

目前已知的植物體內抗壞血酸生物合成途徑中，甘露糖/L-半乳糖途徑（又稱為Smirnoff/Wheeler途徑）是主要途徑[7]。L-半乳糖磷酸化酶（GDP-L-galactose phosphorylase，GGPase）基因的表達產物是L-半乳糖磷酸化酶（GGP），該酶能夠將GDP-L-半乳糖轉化成GDP-L-半乳糖-1-磷酸，是甘露糖/L-半乳糖途徑中的重要基因，對植物抗壞血酸的合成起著重要作用。目前已在擬南芥、獼猴桃、煙草、大豆、蓖麻、柑橘、葡萄、番茄和馬鈴薯等多種植物中分離出GGPase基因。通過轉基因研究表明在多個物種中過量表達GGPase基因可提高植物體內抗壞血酸的含量[7-15]。

對棉花GGPase2基因的克隆、功能分析、原核表達和轉化煙草，有助于解析抗壞血酸參與棉纖維發育的重要功能。從處于快速伸長發育時期的棉花纖維組織中克隆得到了抗壞血酸合成途徑中的關鍵基因（GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因）GGPase2，并對其編碼的蛋白進行序列功能結構域分析，構建原核表達載體并轉化大腸桿菌BL21（DE3）進行重組蛋白的誘導表達，構建植物表達載體并轉化煙草，為深入探究抗壞血酸和GGPase參與棉花纖維發育的重要功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料為陸地棉徐-142棉花纖維，由筆者所在實驗室培養。經液氮速凍后于-70 ℃保存備用。

1.1.2 菌株與質粒 大腸桿菌菌株（Escherichia coli）、Top10由本實驗室保存；克隆載體為大連寶生物pGEM-T vector；原核表達載體為pET28a，真核表達載體為pCAMBIA2300由筆者所在實驗室保存。

1.1.3 酶及生化試劑 RNA反轉錄試劑盒、TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶、T4-DNA 連接酶、EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ和XbaⅠ等相關酶購自大連寶生物公司；DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取微量試劑盒購自TIANGEN公司；其他相關試劑均為國產分析純，購自上海生工生物工程公司。

1.1.4 主要儀器 高壓蒸汽滅菌鍋（HVE-50）、Eppendorf 5417 R型臺式冷凍離心機、電泳儀（Tannon Epson100型）、PCR儀（Biomotra Tpersonal）、凝膠成像系統、超凈工作臺（BHC-1300A/B3）、恒溫培養箱（HIQ-X100）、恒溫搖床（HWY-100B）。

1.2 方法

1.2.1 棉花總RNA的提取 根據改良的CTAB法[16]提取棉花總RNA。所使用的研缽經高溫烘烤數小時，其他器皿均用DEPC水處理[17]。

1.2.2 GhGGPase2基因的克隆 根據從GenBank EST數據庫中所獲得的完整cDNA ORF基因片段進行保守性分析后，利用Primer Premier 5.0進行引物設計（正向引物：5′-CGCGGATCCATGATGCTTAGGATTAAGAGGGTTC-3′；反向引物：5′-CCGCTCGAGCTGCAGAACAAGGCATTGTTG-3′）。設計引物在上下游引物的兩端添加BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點（下劃線）和保護性堿基。用Prime-ScriptTM反轉錄試劑盒以總RNA為模板合成cDNA[18]，通過PCR擴增獲得全長的 GhGGPase2 基因。

PCR反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，57 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸70 s，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃存放。

1.2.3 蛋白質序列比對和結構域分析 蛋白質序列比對通過DNAMAN軟件和NCBI網站在線完成，通過MEGA軟件完成進化樹構建。

1.2.4 pET28a-GhGGPase2原核表達載體的構建與鑒定 將克隆得到GhGGPase2基因的PCR產物經過回收后連接到pGEM-T Easy載體上，將連接產物轉入大腸桿菌Top10感受態細胞中，菌落PCR鑒定后挑取陽性單克隆，搖菌做穿刺管后送至華大基因公司測序[18-19]。將經測序正確的重組質粒pGEM-T-GhGGPase2和pET28a原核表達載體同時用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，回收目的基因小片段和原核表達載體大片段，并將回收好的大小片段按一定體系用T4-DNA 連接酶16 ℃過夜連接，將連接產物轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，涂布于50 mg/L卡那霉素抗性固體LB培養基37 ℃恒溫箱中培養12 h，挑取單克隆進行PCR和雙酶切鑒定[19-20]。

1.2.5 GhGGPase2重組蛋白的誘導表達及SDS-PAGE鑒定 將構建成功的重組質粒pET28a-GhGGPase2和空質粒pET28a轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，經PCR鑒定后挑取陽性單克隆菌落接種于10 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養基中37 ℃培養過夜。各取上述過夜菌500 μL轉接入50 mL含50 mg/L卡那霉素的LB中，37 ℃振蕩培養至D600 nm為0.4～0.6時，各取10 mL菌液記為0 h（作為對照），加入IPTG至終濃度為2 mmol/L，繼續振蕩培養，分別取加入IPTG后2、4、6 h菌液10 mL，4 ℃ 5 000 r/min離心8 min收集菌體然后加入冰預冷PBS磷酸緩沖液懸浮菌體后再加入SDS，100 ℃水浴5 min，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液進行SDS-PAGE電泳（5%濃縮膠，12%分離膠），凝膠用考馬斯亮藍染色[18-19]。

1.2.6 GhGGPase2植物表達載體的構建 將經過測序鑒定正確的pGEM-T-GhGGPase2重組質粒和植物表達載體pCAMBIA2300同時用KpnⅠ和Xba Ⅰ進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收純化所需的目的片段，用T4-DNA Ligase 將回收的目的基因片段與pCAMBIA2300載體大片段相連接，4 ℃過夜；將連接產物轉入到大腸桿菌Top10感受態細胞，涂布于含有卡那霉素（Kan）的LB平板上37 ℃培養過夜。篩選陽性克隆并搖菌提取重組質粒，酶切鑒定，即構建p35S：：GhGGPase2植物表達載體。

1.2.7 煙草的遺傳轉化 將構建好的p35S：：GhGGPase2表達載體用電擊法轉入根癌農桿菌GV3101中，轉化產物涂布在含有100 mg/L Rif+5 mg/L Gen 7+75 mg/L Kan的LB培養基上，28 ℃培養2 d。從平板上挑取單菌落，接種到含Rif、Gen和Kan的LB液體培養基中，28 ℃搖菌培養，PCR鑒定陽性克隆。采用葉盤法轉化煙草[20]：將煙草葉片切成1×1 cm 大小的葉盤，放入鑒定出的農桿菌侵染液中，侵染 10 min，吸干菌液，放入共培養培養基（MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50 mg/L AS）上（鋪濾紙），暗培養2 d后轉移至篩選分化培養基（MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50 mg/L Kan+400 mg/L Cef）上誘導再生芽，每2周換1次培養基。再生芽長至1～2 cm時，將不定芽切下，轉到生根培養基（1/2MS+0.3 mg/L IAA+50 mg/L Kan+400 mg/L Cef）中誘導生根[21]。

1.2.8 轉基因煙草分子鑒定 用天根RNA simple Total RNA Kit提取煙草總RNA，反轉錄合成cDNA第一鏈，以合成的cDNA為模板，利用正向和反向引物進行PCR擴增。PCR反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火 45 s，72 ℃延伸70 s，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃存放。

2 結果與分析

2.1 棉花GhGGPase2基因克隆

采用改良的CTAB法提取棉花纖維組織的總量RNA，結果表明：所提取的總量RNA呈現28S、18S完整條帶，28S的含量約為18S的2倍，表明所提取的RNA較好，可以繼續進行后續反轉錄試驗（圖1-A）。以反轉錄獲得的棉花纖維cDNA作為模板，經過PCR擴增得到特異性條帶，經測序正確后獲得GhGGPase2基因的全長開放閱讀框（圖1-B），包含 1 335 個堿基對的核苷酸，編碼含有445個氨基酸的蛋白質。

2.2 序列比對與進化樹分析

將GhGGPase2基因的cDNA序列翻譯為氨基酸序列，將該序列與以下幾種GGPase基因的氨基酸序列進行對比：擬南芥（AtGGPase；GenBank 登錄號為At4g26850）、番茄（SlGGPase；GenBank 登錄號為AFD54988）、馬鈴薯（StGGPase；GenBank 登錄號為AEQ64271）、獼猴桃（AdGGPase；GenBank 登錄號為ABP65665）、煙草（NtGGPase；GenBank 登錄號為ACD92981）、蓖麻（RcGGPase；GenBank 登錄號為XP_002529463）、柑橘（CuGGPase；GenBank 登錄號為ADV59925）、葡萄（VvGGPase；GenBank 登錄號為XP_002278339）。結果顯示：植物中的GhGGPase2蛋白質在序列相似性較高，具有保守的結構域，黑色部分為保守的氨基酸序列，灰色部分為保守性一般的序列。GhGGPase2蛋白和其他植物一樣含有1個HIT（HxHxQ）基序，是組氨酸三聯體（HIT）超家族的一員。它也是一種核定位蛋白，核定位基序為NLS（圖2）。進化樹分析的結果表明棉花GhGGPase2與柑橘AdGGPase在進化上親緣關系上較近（圖3）。

2.3 原核表達載體pET28a-GhGGPase的構建與鑒定

將經測序正確的重組質粒pGEM-T-GhGGPase2和pET28a原核表達載體同時用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，回收目的基因小片段和原核表達載體大片段，連接并轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，轉化成功的菌株挑取單克隆做菌落PCR鑒定（圖4-A），PCR鑒定為陽性的菌落搖菌提取質粒進一步做雙酶切鑒定（圖4-B），成功構建pET28a-GhGGPase2原核表達載體。

2.4 重組GhGGPase2蛋白的誘導表達

將構建成功的pET28a-GhGGPase2重組子轉入表達菌

株BL21（DE3）中，經PCR篩選鑒定后（圖5），進行擴大培養，利用IPTG誘導菌體表達，提取蛋白質后進行SDS-PAGE電泳分析，獲得了49 ku左右的重組GhGGPase2蛋白（圖6）。

2.5 p35S：：GhGGPase2植物表達載體構建

將經測序正確的重組質粒pMD-T-GhGGPase2和pCAMBIA2300真核表達載體同時用BamHⅠ和Xba Ⅰ進行雙酶切，回收目的基因小片段和真核表達載體大片段。連接后轉化大腸桿菌Top10感受態細胞培養。經PCR和雙酶切鑒定均含有目的片段，表明成功植物表達載體p35S：：GhGGPase2 （圖7）。

2.6 煙草的遺傳轉化與鑒定

采用電擊法將重組質粒p35S：：GhGGPase2轉化農桿菌GV3101，經篩選和PCR鑒定，結果PCR擴增條帶與預期大小一致，表明p35S：：GhGGPase2植物表達載體已經成功導入到農桿菌GV3101中，可用于下一步的遺傳轉化 （圖8-A）。

將已經成功導入p35S：：GhGGPase2重組質粒的農桿菌GV3101采用葉盤法轉化野生型煙草，誘導芽再生和生根，獲取再生的轉基因煙草。提取轉基因煙草葉片總量RNA并反轉錄合成cDNA，以p35S：：GhGGPase2質粒作陽性對照，非轉基因煙草作陰性對照，通過RT-PCR利用特異性引物鑒定轉基因植株，結果顯示成功獲得了轉基因煙草植株（圖8-B）。

3 討論

本研究從棉花纖維組織中克隆得到GhGGPase2基因，該基因cDNA的開放閱讀框為1 335 bp。GhGGPase2擁有保守的HxHxQ功能結構域，是D-半乳糖-1-磷酸鳥苷酰基轉移酶（GalT）家族和組氨酸三聯體（HIT）超家族的一員，這些功能結構可能與棉花抵御非生物脅迫的能力相關。進化樹分析的結果表明棉花GhGGPase2與柑橘AdGGPase在進化上親緣關系上較近。構建了原核表達載體pET28a-GhGGpase2，轉化大腸桿菌，通過誘導表達和SDS-PAGE分析獲得了大小約為49 ku的GhGGPase2重組蛋白質。構建了真核表達載體p35S：：GhGGPase2，導入農桿菌GV3101，通過葉盤法轉化野生型煙草，誘導芽再生和生根，獲得了再生的轉基因煙草。

抗壞血酸參與一系列植物的生長發育過程，并且可以影響氧化還原反應相關的進程，包括病原反應[22-23]。植物體內抗壞血酸合成途徑中從GDP-甘露糖轉化為L-半乳糖/L-古洛糖的過程中以糖醛酸作為前體，編碼GDP-甘露糖途徑中相關酶的基因已經被證實和鑒定。在擬南芥中AtGGPase基因編碼GDP-L-半乳糖磷酸化酶，該酶催化抗壞血酸合成過程中GDP-L-半乳糖轉化為L-半乳糖-1-磷酸的這一步反應。GDP-甘露糖途徑是擬南芥幼苗抗壞血酸來源的主要且顯著的途徑，并且抗壞血酸是幼苗生長所必需的[24-25]。光合作用的電子傳遞鏈與擬南芥中L-半乳糖途徑中的酶相互關聯，持續光照可以使擬南芥體內的抗壞血酸含量增加，與此同時該途徑中的的GMPase、GGPase、GPPase的表達量也上升；強光處理后擬南芥體內的抗壞血酸含量增加，同時GGPase表達和GGPase的酶活快速升高，該途徑中的其他酶的酶活變化不是很大；擬南芥中光周期的開始階段是GGPase和VTC5的表達高峰期，并且其表達受到生物鐘的調控[14]。擬南芥中GGPase蛋白具有底物特異性，底物GDP-L-半乳糖比GDP-D-甘露糖更容易被GGPase蛋白利用，而不宜以GDP-L-葡萄糖為底物[15]。

4 結論

本試驗從棉花纖維組織中克隆獲得GhGGPase2基因是抗壞血酸生物合成中的關鍵基因，調控著植物體內抗壞血酸的生物合成，預示著其可能通過影響抗壞血酸含量從而參與纖維細胞的發育過程。結果將為深入研究GhGGPase基因的生物學功能以及為解析棉花纖維細胞發育的分子機制提供參考，同時也為利用基因工程進行優質轉基因新品種的培育奠定了一定的基礎。

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