基于EST序列的甘蔗SNP發(fā)掘及分析

檀小輝　張繼　梁芳

摘要：從NCBI中的EST數(shù)據(jù)庫下載已公布的甘蔗EST序列28 512條，利用DNAStar軟件中的Seqman程序進行疊連群構(gòu)建，EST序列共構(gòu)建3 449個疊連群，從中篩選出93個疊連群，長度共計105 385 bp，發(fā)現(xiàn)候選SNP位點 1 449個，SNP平均出現(xiàn)頻率為1.37%，共有74個contigs含有SNP位點，平均每個contig含有19.58個SNP位點，含有SNP位點數(shù)最多的1個疊連群有229個SNP候選位點，不同的疊連群含有的SNP位點數(shù)量差異較大，但轉(zhuǎn)換類型與顛換類型所占比例很接近。本研究所用的疊連群的總長度是105 385 bp，平均72.93 bp含有1個SNP位點。

關(guān)鍵詞：甘蔗；NCBI；EST序列；DNAStar；SNP位點

中圖分類號： S566.101 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0064-03

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）指基因組內(nèi)DNA序列在某一特定的核苷酸位置發(fā)生缺失、插入、顛換、轉(zhuǎn)換等變化。作為第3代遺傳標(biāo)記，已在動植物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[1]、重要性狀的基因定位[2]、多樣性分析[3]以及品種鑒定[4]等相關(guān)研究中得到廣泛的應(yīng)用，跟以簡單序列重復(fù)（SSR）為代表的第2代分子標(biāo)記相比，SNP具有易于實現(xiàn)自動化分析、遺傳穩(wěn)定性強、密度高等優(yōu)點。但SNP標(biāo)記開發(fā)在前期測序階段成本較高而限制了SNP相關(guān)標(biāo)記的大規(guī)模開發(fā)。因此，利用已有數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)進行相關(guān)分析來開發(fā)SNP標(biāo)記，然后通過相關(guān)試驗對候選SNP標(biāo)記加以驗證，已成為一種降低成本且快捷高效的SNP開發(fā)途徑[5]。

表達序列標(biāo)簽 （expressed sequence tags，EST）是來源于功能基因表達的cDNA片段，是轉(zhuǎn)錄區(qū)域多態(tài)性識別的重要資源，隨著相關(guān)研究的深入，公共數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列中EST序列的增速最快，以EST序列為基礎(chǔ)開發(fā)分子標(biāo)記，變得越來越方便。目前，常用的EST標(biāo)記有EST-AFLP、EST-RFLP、EST-SSR、EST-SNP等[6]。除了具有一般分子標(biāo)記的特點，EST標(biāo)記還具有通用性好、信息量大、開發(fā)方法簡單快捷以及成本低等優(yōu)點。因為EST序列是基因表達區(qū)的cDNA序列，所以EST序列為基礎(chǔ)開發(fā)出的SNP位點很可能與表達基因的功能密切相關(guān)，或者直接在基因的編碼區(qū)之內(nèi)，可直接用于動植物分子育種等相關(guān)領(lǐng)域的研究[7]。而且在EST序列中，SNP頻率很豐富[8]。因此，在尚未獲得基因組全序列的動植物中，開發(fā)EST-SNP標(biāo)記具有重要意義[9]。但NCBI中甘蔗dbEST數(shù)據(jù)庫中的EST-SNP研究在國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道，本研究利用NCBI上公布的甘蔗EST數(shù)據(jù)中篩選SNP候選位點，為甘蔗EST-SNP標(biāo)記的開發(fā)以及后續(xù)的分子生物學(xué)研究奠定一定的基礎(chǔ)。截至2014年10月，NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫中已收錄了甘蔗EST序列28萬多條，如此龐大的數(shù)據(jù)為從甘蔗EST序列中開發(fā)SNP標(biāo)記提供了良好的數(shù)據(jù)支持，甘蔗EST-SNP標(biāo)記的開發(fā)可為甘蔗分子育種和基因組學(xué)等方面的研究提供重要的技術(shù)支持，本研究從NCBI中的dbEST數(shù)據(jù)庫中下載了28 512條EST序列，利用DNAStar軟件中的Seqman程序拼接得到3 449個重疊群（contigs），并將拼接結(jié)果進行人工篩選，為提高候選SNP位點的可靠度，本研究選用的EST序列拼接而成的contigs都至少含有20條EST序列，每個候選位點都至少有5條EST序列的相關(guān)位點作為支持，旨在發(fā)掘甘蔗的EST-SNP位點和尋求能得到大量可靠的候選SNP位點的篩選方法。

1 材料與方法

2014年10月13日從美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站dbEST數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/？term=sugarcane）下載28 512條甘蔗EST序列，所有序列均以FASTA格式保存，未得到可靠性較高的SNP候選位點，本研究用DNAStar軟件中的Seqman程序檢測并去除所有EST序列的載體序列，然后組裝拼接成contigs。因為本研究選取DNAStar軟件進行EST-SNP候選位點的開發(fā)，因此篩選步驟主要分為以下幾類：（1）在Seqman的拼接結(jié)果中提取包含20條以上EST序列的contigs，并在其中篩選候選SNP位點；（2）候選SNP位點兩側(cè)至少有5 bp堿基要完全保守為原則對候選SNP位點進行人工篩選；（3）對篩選結(jié)果進行整理、歸納、分析。

SNP發(fā)掘：應(yīng)用Seqman程序的SNP工具查找SNP候選位點。

SNP頻率計算：SNP頻率=（候選SNP數(shù)目/contigs長度）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選位點的人工篩選

對候選軟件篩選出的SNP位點根據(jù)2個篩選原則進一步人工將可靠度較高的SNP位點篩選出來：（1）候選SNP位點中的次要等位基因頻率至少為30%[10]；（2）候選SNP位點兩側(cè)至少有5 bp完全保守的序列。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，在包含不小于4條EST序列的contigs中篩選SNP時，候選SNP位點的主要、次要等位基因出現(xiàn)的頻率之比約為1 ∶ 1時的可靠度最高[11]。為了進一步提高候選SNP位點的可靠度，本研究在篩選SNP候選位點時，把包含4條EST序列的contigs提高到至少包含20條EST序列的contigs，同時，在1個候選SNP位點的兩側(cè)經(jīng)常會出現(xiàn)間斷或連續(xù)的非SNP位點的不保守區(qū)域，這些區(qū)域可能是在比對時序列錯誤引起的，從而降低了候選SNP位點的可靠度，因此本研究規(guī)定候選SNP位點兩側(cè)至少5序列必須完全保守（圖1為合格SNP候選位點，圖2及圖3為不合格SNP候選位點）。

2.2 甘蔗EST序列SNP頻率分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載28 512條甘蔗EST序列，通過序列組裝構(gòu)建3 449個contigs，為了提高SNP候選位點的可靠性，本研究所用的contigs均為EST序列條數(shù)大于20的contigs，經(jīng)過篩選，共有92個contigs符合要求，92個contigs的堿基總數(shù)為105 385個bp，發(fā)現(xiàn)1 449個SNP位點，SNP出現(xiàn)的頻率為1.37%，平均72.93個bp含有1個SNP位點。總共有74個contigs含有SNP位點，平均1個contig含有1958個SNP位點（表1），含有SNP位點數(shù)目最多的contig中含有281個SNP候選位點，含有5、8個SNP候選位點的contigs最多（8個）（表2）。

本研究使用的EST序列包含SNP位點以堿基的顛換（49.00%）和轉(zhuǎn)換（49.07）為主，其中堿基的插入、缺失的數(shù)量最少，占全部SNP的1.93%，不同疊連群所含不同突變類型SNP位點的數(shù)量差異較大，所以分布密度的變化也很大（表3）。

由甘蔗EST序列構(gòu)建的contigs中，組成contigs的EST序列條數(shù)和組成contigs的堿基數(shù)不同，得到SNP位點的頻率也就不同，組成contigs的堿基數(shù)越多，其SNP位點的頻率就越大。表4為甘蔗EST序列組成的序列數(shù)最多的10個contigs及SNP出現(xiàn)頻率，這10個contigs共組裝了5 053條序列，SNP平均出現(xiàn)頻率為3.48%，明顯高于所有用于篩選候選位點的contigs的SNP出現(xiàn)頻率1.37%，所以大規(guī)格contigs（多序列、多堿基數(shù)）更易得到候選SNP位點。另外，檢測 EST-SNP位點時，需大量冗余EST序列作為其檢測的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，如果EST條數(shù)少，得到的結(jié)果可能就不太理想，這也是本研究用至少包含20條EST序列的contigs進行SNP位點篩

3 結(jié)論與討論

SNP廣泛分布于動植物的基因組中，是動植物基因組中可遺傳變異中最常見的一種，據(jù)估計，SNP在人類基因組中廣泛分布，平均每500～1 000 bp對中就有1個SNP，其總數(shù)可能在300萬個以上[12]。作為第3代遺傳標(biāo)記，由于SNP具有許多獨特的優(yōu)點，自從1994年問世以來，已越來越被分子標(biāo)記領(lǐng)域的相關(guān)研究人員所重視，特別是cDNA的SNP，因其本身就是功能基因表達的組成部分，所以SNP被公認(rèn)為新一代分子標(biāo)記中最有應(yīng)用前景的一類。然而，由于SNP的開發(fā)難度大、檢測成本高，需要高額的資金投入以及大量的時間投入，導(dǎo)致該標(biāo)記在甘蔗基因組研究領(lǐng)域的應(yīng)用很少。但是如果以生物信息學(xué)為技術(shù)基礎(chǔ)，以大量冗余EST序列為數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，EST-SNP的開發(fā)就成為一種既高效又廉價的方法[7，13-14]。但是，目前有很多因素都限制了EST-SNP的發(fā)掘，比如為了節(jié)約成本，EST序列在測序時只進行單向測序，測序結(jié)果的低質(zhì)量進而導(dǎo)致篩選SNP位點會有預(yù)測已經(jīng)查找方面的錯誤；EST序列來源對SNP位點的篩選也有很大的影響。但是，通過改進方法，可以對EST-SNP位點進行更準(zhǔn)確、高效的發(fā)掘。通過有28萬多條EST可以看出，人們對甘蔗的關(guān)注度很高，但是到目前為止還沒有在NCBI中的SNP數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)甘蔗SNP的相關(guān)數(shù)據(jù)，這可能與甘蔗是由多倍體原種熱帶種（2n=80，x=10）與多倍體野生種割手密（2n=40～128，x=8）經(jīng)過一系列雜交之后形成的異源多倍體有關(guān)，其遺傳背景非常復(fù)雜，染色體數(shù)在100～150條之間，因此甘蔗在分子遺傳連鎖圖譜、質(zhì)量性狀基因定位、數(shù)量性狀基因定位以及分子標(biāo)記輔助輔助育種方面遠遠落后于其他作物[15]。因此，本研究對甘蔗SNP標(biāo)記的開發(fā)研究就更具有重要意義，為了保證SNP位點的準(zhǔn)確性，對滿足SNP位點contigs包含的EST序列的要求就更高，必須是包含20條以上的EST序列序列組成的contigs，這樣一來可能會有大量的真正的SNP位點被遺漏。但是當(dāng)contigs所含EST序列較少時，又可能會有大量的EST序列無法被利用，EST序列不能被用于SNP位點的篩選，因此，筆者認(rèn)為只有當(dāng)contigs所含EST數(shù)目超過一定程度，篩選出的候選EST-SNP位點的可靠性才會有保證；只有當(dāng)dbEST數(shù)據(jù)庫中EST序列達到一定程度之后，其利用率才會得到保證，篩選出的SNP位點的可靠性才會更高。例如，利用全基因組測序，在水稻中（品種為日本晴和9311）獲得了5 019 016個SNP位點[16]，另外，分布于基因表達調(diào)控區(qū)，以及外顯子和內(nèi)含子區(qū)域的SNP可能和基因的功能直接相關(guān)[17]。同時，對contigs中所含的SNP數(shù)量進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，組成contigs的EST序列條數(shù)越多，堿基數(shù)越多，發(fā)現(xiàn)的候選SNP位點的數(shù)量也就越多，這同Duran等在研究大麥EST序列時發(fā)現(xiàn)的結(jié)果基本一致但是具體每個類型的contigs所含的SNP位點數(shù)沒有發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律[18]，這可能跟不同物種其多態(tài)性位點分布不同有關(guān)。

大多數(shù)動植物沒有全基因組序列的數(shù)據(jù)，但是有大量的EST數(shù)據(jù)可供大家分析利用，EST本身就是表達基因的片段，因此基于EST序列的的SNP可能與基因的功能以及目標(biāo)的性狀有更多的關(guān)聯(lián)，本研究從NCBI中的dbEST序列中下載了28 512條甘蔗EST序列，分析了92個由EST序列組成的contigs，這些contigs長度共計105 385 bp，發(fā)現(xiàn)候選SNP位點 1 449 個，SNP平均出現(xiàn)頻率為3.48%，總共有74個contigs含有SNP位點，平均1個contig含有19.58個SNP位點，平均每72.93 bp發(fā)現(xiàn)1個候選SNP位點，低于水稻基因組中SNP發(fā)生頻率接近（水稻平均每89 bp有1個SNP）[19]，高于玉米基因組SNP發(fā)生頻率（玉米基因組平均每61 bp有1個SNP）[9]。由此可見，SNP在禾本科植物中的發(fā)生頻率相差不大。接下來準(zhǔn)備根據(jù)發(fā)掘到的SNP位點設(shè)計相應(yīng)的SNP引物，并進行測序和酶切相結(jié)合的方法來驗證發(fā)掘的SNP位點的可靠性，以期為甘蔗的分子遺傳研究提供一定的參考。

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