正交設計優化荷花品種ISSR—PCR反應體系

桂騰琴　伍偉　盧鵬

摘要：以東方明珠荷花為試驗材料，應用L9（34）正交設計，探討反應體系中引物、Taq DNA聚合酶等4個不同因素的3個水平對荷花品種反應體系的影響，正交設計所用引物為UBC843，PCR結果應用MINITAB軟件進行方差分析和極差分析。結果表明，荷花最佳ISSR-PCR反應體系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.20 mmol/L dNTPs，0.40 μmol/L引物，20～80 ng 模板DNA，1.00 U Taq DNA聚合酶。優化的ISSR-PCR反應體系穩定性高、重復性較好，為從分子水平對荷花品種進行各項研究奠定了基礎。

關鍵詞：荷花；正交設計；ISSR-PCR；體系優化

中圖分類號： S188；Q943.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0071-03

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）為睡蓮科蓮屬植物，是中國傳統的十大名花之一，素有“活化石”之稱[1]。安龍荷花種質資源豐富，但優良品種較少，在長期自然雜交過程中，不僅形成了類型多樣的品種，而且品種間的親緣關系也較為復雜，給荷花種質資源的收集、保存、研究等帶來了不便。傳統的形態指標容易受到生態環境及基因顯隱性影響，不能客觀地估計遺傳變異性。因此，從分子水平對荷花品種的親緣關系和遺傳多樣性進行研究是非常必要的。1994年Zietkiewicz等創建了簡單重復序列間擴增（inter-simple sequence repeat，ISSR）技術[2]，它具有穩定性、可操作性、多態性高等優點[3]，但是ISSR-PCR易受諸多因素如Taq DNA聚合酶、引物、退火溫度等干擾，而且不同物種 ISSR-PCR 最佳反應體系的差別也很大[4-5]。正交試驗設計可以克服傳統單因素試驗的不足，考慮各因子的相互作用，具有齊整可比、均衡分散等優點[6]，能通過較少的試驗組合快速找到最佳反應體系[7]。黃宇等以6份荷花品種的葉片為材料，采用單因素方法優化ISSR-PCR反應體系[8]；孫祖霞等以荷花品種新紅的葉片為材料，采用L16（45）正交設計優化荷花相關序列擴增多態性PCR（SRAP-PCR）反應體系[9]；徐君等也是采用單因素方法優化ISSR-PCR反應體系[10]。迄今為止，關于荷花品種ISSR-PCR反應體系正交優化的報道較少，本研究擬用L9（34）正交設計優化反應體系，以期為后續研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為東方明珠，其花瓣采于貴州省安龍縣招堤荷花池，花瓣采集后用硅膠干燥，正交設計過程中用到的引物為UBC 843（CT）8RA。

1.2 DNA的提取

東方明珠花瓣DNA的提取參考桂騰琴等方法[11]；DNA純度、濃度用UV-4501S紫外分光光度計測定；DNA質量用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 正交試驗設計

采用L9（34）正交設計，各因素-水平組合見表1。每個處理重復2次，反應總體積為25 μL。反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50.6 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35 個循環；72 ℃ 7 min，擴增結束后于4 ℃保存。PCR擴增產物用1.4 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色電泳后，在Bio-RAD凝膠成像系統中進行觀察和分析。

1.4 退火溫度的確定

設定6 個退火溫度：47.6、48.6、49.6、50.6、51.6、53.6 ℃，選用正交設計確定的最佳反應體系對引物UBC 843（CT）8RA退火溫度進行篩選試驗，其余參數不變。

2 結果與分析

2.1 正交設計分析

計分參照何正文等方法[12]，根據條帶的多少、特異性與清晰程度依次打分：條帶多而亮、清晰，記9分；最低分記1分；2次重復獨立計分。9個組合的分數（2次重復）依次為：3、3；8、7；4、6；9、9；6、5；7、1；1、4；5、8；2、2。由圖1可見：第7號、第9號、第6號、第9號處理效果較差，背景深、條帶少，且條帶不整齊；第4號處理最好，2次重復擴增條帶比較穩定，條帶多且清晰。

2.2 各因素不同水平對PCR的影響

為確定最佳的PCR反應體系，需要對各因素不同水平進行多重比較。極差的大小表明該因素對PCR擴增影響的強弱。由表2可以看出：引物濃度對PCR擴增的影響最強，其次是TaqDNA聚合酶，影響最弱的是dNTPs。正交試驗擴增的結果用MINITAB軟件進行方差分析，由表3可知：方差分析與極差分析的結果比較一致；引物不同水平間差異在方差分析中達到顯著水平（P<0.05），其余因素在水平間差異不顯著。

2.2.1 Taq DNA聚合酶濃度對PCR擴增結果的影響 由表2可知，Taq DNA聚合酶濃度在該試驗中是影響PCR擴增的次要因素。由圖2可以看出：Taq DNA聚合酶在 1.00 U/25 μL 水平差異明顯，而在0.75 U/25 μL（1、4、7號處理）、1.50 U/25 μL（3、6、9號處理）2個水平差異不明顯；Taq 酶量為1.00 U/25 μL（2、5、8號處理）擴增的條帶清晰，條帶豐富。綜合結果可知，1.00 U/25 μL為Taq酶最佳濃度，與劉藝平等的研究結果[13-14]一致。

2.2.2 Mg2+濃度對PCR擴增結果的影響 圖2顯示：Mg2+濃度3個水平對PCR擴增影響不明顯，Mg2+濃度為 2.0 mmol/L 時均分最大；Mg2+濃度為2.5 mmol/L時，均分呈下降趨勢。最終確定Mg2+的最佳濃度為2.0 mmol/L。

2.2.3 dNTPs濃度對PCR擴增結果的影響 從圖2可以看出：dNTPs濃度為0.15 mmol/L（1、6、8號處理）、0.25 mmol/L（3、5、7號處理）時，擴增條帶少且不穩定；dNTPs 濃度為 0.20 mmol/L 時，PCR擴增均分最高，確定其為最佳dNTPs 濃度。

2.2.4 引物濃度對PCR擴增結果的影響 本試驗中影響PCR擴增的主要因素是引物濃度（表2）。引物濃度為0.20、0.30 μmol/L時，均值差異不明顯；當濃度為0.40 μmol/L（3、4、8號處理）時，均值達到最大（圖2）。因此，選擇引物最佳濃度為0.40 μmol/L，與李立升等研究結果[15-16]相同。

2.3 PCR擴增退火溫度的確定

ISSR引物退火溫度對PCR擴增結果影響很大。由圖3可見：當退火溫度為47.6、48.6、49.6 ℃時，擴增不穩定且條帶少；當退火溫度為50.6、51.6 ℃時，擴增條帶清晰且數量多、穩定。可見，在ISSR-PCR擴增中適當提高退火溫度可

以增加特異性條帶，因此引物UBC 843的最適退火溫度為51.6 ℃。

2.4 最優體系的確定和穩定性驗證

綜上所述，荷花品種最佳ISSR-PCR反應體系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.20 mmol/L dNTPs，0.40 μmol/L 引物，20～80 ng 模板DNA，1.00 U Taq DNA聚合酶。利用引物UBC 827在退火溫度為51.6 ℃的條件下進行體系穩定性檢測，圖4表明：體系穩定、效果好，可用于荷花品種親緣關系和遺傳多樣性的研究。

3 討論與結論

正交設計可以克服傳統的單因素試驗和完全組合設計不足，從復因子試驗中挑選出有代表性的水平組合進行試驗，節約了成本、時間，具有齊整可比、均衡分散等優點[6，17]。但是對正交設計擴增結果進行直觀分析有一定的主觀性和隨意性[18-19]，要么可以適當增加試驗重復次數，從而增加對PCR擴增的評判次數，來減少打分誤差，使試驗數據更可靠[4]，要么也可以借助分析軟件對結果進行分析。

PCR擴增結果受物種[4-5，7]、擴增程序、多因子等綜合影響，退火溫度很小的變動就會引起擴增結果很大的變化。本試驗中各因素對PCR擴增的影響由強到弱為：引物濃度﹥Taq DNA聚合酶濃度﹥Mg2+濃度﹥dNTPs濃度，結果與任風鳴等的研究結果[20]相似。而梨的正交試驗[21]和李偉等對鎖陽的ISSR-PCR優化研究[5]認為，對PCR影響最關鍵的是Taq DNA聚合酶，其次是引物濃度。孫清信等研究表明，模板DNA濃度對ISSR-PCR擴增影響最小[22-23]，對荷花品種模板DNA濃度進行單因素優化時也得到相似的結果，模板DNA濃度在20～80 ng/25 μL均能擴增出條帶，且條帶清晰；但是如果模板DNA不純，則導致擴增條帶少或無擴增條帶[21，24]。出現這些差異要么與物種、引物特異性有關，要么與主觀評價有關。因此，為了更好地將正交設計廣泛應用于研究中，既可以建立客觀的評判標準，也可以提高分析結果的可信度。

綜合考慮后得出荷花品種最佳反應體系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.20 mmol/L dNTPs，0.40 μmol/L 引物，20～80 ng 模板DNA，1.00 U Taq DNA聚合酶。該反應體系在其他引物中擴增獲得了清晰的條帶，為后續研究奠定了堅實基礎。

參考文獻：

[1]張行言. 中國荷花新品種圖志I[M]. 北京：中國林業出版社，2011：1-2.

[2]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.

[3]Syamkumar S，Sasikumar B. Molecular marker based genetic diversity analysis of Curcuma species from India[J]. Scientia Horticulturae，2007，112（2）：235-241.

[4]唐 輝，陳宗游，史艷財，等. 正交設計優化地楓皮ISSR-PCR反應體系[J]. 中草藥，2013，44（5）：610-615.

[5]李 偉，劉廣達，陳 青，等. 鎖陽ISSR-PCR反應體系的優化研究[J]. 生物技術通報，2012（8）：135-140.

[6]明道緒. 生物統計附試驗設計[M]. 3版.北京：中國農業出版社，2007：286-287.

[7]王 軍，楊榮萍，洪明偉，等. 石榴SPAR-PCR反應體系的正交設計優化及驗證[J]. 云南農業大學學報，2013，28（3）：376-379.

[8]黃 宇，何天友，榮俊冬，等. 荷花ISSR-PCR反應體系的建立及優化[J]. 亞熱帶農業研究，2009，5（4）：284-288.

[9]孫祖霞，劉兆磊，陳素梅，等. 荷花SRAP-PCR反應體系的優化與確立[J]. 南京農業大學學報，2011，34（6）：53-58.

[10]徐 君，李靜會，李 欣，等. 荷花ISSR引物篩選及反應體系優化[J]. 江蘇農業科學，2014，42（10）：42-44.

[11]桂騰琴，喬愛民，孫 敏，等. 果梅基因組DNA提取方法的比較及ISSR分析[J]. 北方園藝，2008（4）： 212-215.

[12]何正文，劉運生，陳立華，等. 正交設計直觀分析法優化PCR條件[J]. 湖南醫科大學學報，1998，23（4）：76-77.

[13]劉藝平，李 創，李 娜，等. 荷花遺傳多樣性的ISSR標記分析[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2013，41（4）：139-146.

[14]孔德政. 荷花的民族植物學及河南地區品種資源研究[D]. 鄭州：河南農業大學，2011：100-101.

[15]李立升. 21個荷花品種遺傳多樣性的ISSR分析[D]. 鄭州：河南農業大學，2011：20-20.

[16]刁松鋒，邵文豪，姜景民，等. 多用途樹種無患子 ISSR-PCR 體系建立與檢測[J]. 廣西植物，2015，35（6）：899-904.

[17]桂騰琴，孫 敏，喬愛民. 正交設計優化果梅ISSR反應體系[J]. 果樹學報，2009，26（1）：108-112.

[18]王彥華，侯喜林，徐明宇. 正交設計優化不結球白菜ISSR反應體系研究[J]. 西北植物學報，2004，24（5）：899-902.

[19]謝運海，夏德安，姜 靜，等. 利用正交設計優化水曲柳ISSR-PCR反應體系[J]. 分子植物育種，2005，3（3）：445-450.

[20]任風鳴，胡開治，劉燕琴，等. 傳統中藥金錢草ISSR-PCR反應體系的正交優化研究[J]. 中國中藥雜志，2014，39（12）：2233-2238.

[21]桂騰琴，孫 敏，陸春連，等. 梨ISSR-PCR反應體系的正交優化研究[J]. 西南師范大學學報：自然科學版，2014，39（12）：37-42.

[22]孫清信，陳 堅，張 輝，等. 紫云英ISSR引物的篩選及PCR反應體系的優化[J]. 植物遺傳資源學報，2012，13（5）：870-878.

[23]姜 靜，楊傳平，劉桂豐，等. 樺樹ISSR-PCR反應體系的優化[J]. 生態學雜志，2003，22（3）：91-93.

[24]范海艷，曹福祥，彭繼慶，等. 博白大果油茶ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J]. 中南林業科技大學學報，2011，31（4）：97-103.