甘藍型油菜離體培養再生體系的優化

郭婷婷　周曉嬰　張維

摘要：為優化甘藍型油菜離體培養再生體系，本研究分析了影響再生頻率的多個關鍵因素，包括品種、外植體類型、苗齡、預培養時間以及激素濃度與配比等。結果表明：品種對再生頻率影響較大，Westar的外植體再生頻率高于寧油18號和中雙11號；不同外植體再生頻率也存在差異，子葉柄的再生頻率顯著高于下胚軸；苗齡以4 d較好，預培養時間以2 d較適宜；預培養基中激素2，4-D最適濃度為1 mg/L，分化培養基中，6-BA/NAA比例為10 ∶ 1時子葉柄的再生頻率最高，為70.79%，6-BA/NAA比例為9 ∶ 1時下胚軸的再生頻率最高，達到96.73%。經過優化后，油菜外植體再生頻率得到顯著提高。

關鍵詞：油菜；離體培養；再生；優化；影響因素

中圖分類號： S634.304+.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0076-04

油菜為世界第二大油料作物[1-3]，也是我國重要油料作物之一，在人類的生活和農業生產上有著極其重要的作用。油菜花具有一定觀賞價值，可用作旅游資源；油菜的莖葉可食用，還可用來飼養動物；油菜種子不僅可用來榨取食用油，餅粕還可用來做飼料。此外，油菜屬于可再生資源，低芥酸菜籽油中的脂肪酸碳鏈組成與柴油分子碳數相近，因此被認為是生物柴油最理想的原料[4]。當今育種學家把提高油菜產量和品質，培育抗病和抗逆油菜新品種作為重要內容來研究[5]。

目前，組織培養技術被廣泛地應用到油菜育種中[6]，并得到了大量不同優良特性的油菜種質資源[7-12]。高效的植株再生體系是油菜基因工程育種中的重要環節。在已有的研究報道中[13-18]，油菜可用下胚軸、子葉柄、根、莖、小孢子等作為外植體來進行組織培養。經過多年研究，國內外許多機構已建立了較為成熟的油菜離體培養再生體系[19-21]。然而，研究表明，在油菜組織培養中，不同基因型、不同外植體之間的最佳再生條件存在差異，這在一定程度上阻礙了油菜轉基因研究的發展。本研究主要對影響油菜離體培養再生體系的關鍵因素進行分析，以期摸索出一套穩定、高效的油菜遺傳轉化體系，為油菜組織培養提供基礎數據，并進一步為通過植物轉基因技術獲得預期優良性狀的油菜新種質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試油菜品種有Westar、寧油18號、中雙11號，由江蘇省農業科學院經濟作物研究所提供。

1.2 試驗方法

本試驗主要研究油菜離體培養再生體系的關鍵影響因素，包括：品種、外植體類型、苗齡、預培養時間、激素濃度和配比等。其中品種有3個，即：Westar、寧油18號、中雙11號；外植體類型包括子葉柄和下胚軸；苗齡分為4、5、6 d，預培養時間分為1、2、3 d；2，4-D濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/L；在固定NAA或6-BA濃度的基礎上（NAA基本濃度為0.4 μmol/L，6-BA基本濃度為4 μmol/L），將6-BA/NAA的配比分別調整為9 ∶ 1、10 ∶ 1、11 ∶ 1。以期從上述組合中篩選出最適合的油菜離體培養再生體系。

1.3 培養基配方

無菌苗生長培養基：1/2MS+20 g/L蔗糖+0.8%瓊脂，pH值5.8；預培養基：MS+1.0 mg/L 2，4-D+9.8 μg/L AS（乙酰丁香酮），pH值5.8；芽誘導培養基：MS+0.4 μmol/L NAA+4 μmol/L 6-BA+0.2 g/L PVP（聚乙烯比咯烷酮）+5 μmol/L MES（乙-嗎啉乙磺酸）+200 μmol/L AdSO4（硫酸腺嘌呤）+15 μmol/L AgNO3+250 mg/L Carb（羧芐青霉素）+0.2 μmol/L GA3+30 g/L 蔗糖+2 g/L Gelrite（植物凝膠），pH值5.8；MS培養基：MS+30 g/L 蔗糖+250 mg/L Carb +2 g/L Gelrite，pH值5.8。

1.4 離體培養程序

1.4.1 無菌苗培養 取大離心管1支，倒入種子，加適量的“84消毒液”滅菌，不停振蕩20 min，再用無菌水沖洗5遍，每次30 s。清洗完的種子鋪在MS培養基中，每瓶培養基50～60粒，然后將培養瓶在（25±1） ℃黑暗條件下培養3 d。后移至光下培養1 d，在25 ℃、光照度為2 000 lx、16 h/d光照條件下培養，待用。

1.4.2 預培養 將培養4～6 d的無菌苗，在底部放置了MS濕潤濾紙的滅菌培養皿中，用解剖刀切下2個子葉中較大的子葉柄和下胚軸，下胚軸切成5～10 mm的小段，將切下的外植體置于預培養基上預培養2 d。

1.4.3 芽誘導培養 預培養后，將外植體轉入芽誘導培養基中，在強光照下25 ℃培養4周。每隔2周換1次新鮮培養基，以保證芽的正常生長。

1.4.4 壯芽生長 將外植體轉移至壯苗培養基上繼續培養2～4周，16 h/d光照，25 ℃；待芽長至2～4 cm時，切分芽于MS培養基上，進一步生長。

2 結果與分析

2.1 品種和外植體對油菜離體培養再生頻率的影響

采用4 d苗齡、在預培養基上預培養2 d的不同油菜品種子葉柄和下胚軸，在芽誘導分化培養基上進行誘導培養。1周左右，切口處膨大突起，陸續長出質地緊密、大小不一的淺綠色愈傷組織，10 d左右愈傷組織分化出青綠色的嫩芽。不同油菜品種離體培養再生頻率存在顯著差異（表1），Westar、寧油18號和中雙11號3個品種子葉柄的平均再生頻率分別為7079%、50.05%、35.18%，下胚軸的平均再生頻率分別為5853%、28.15%、13.74%。可以看出，無論是子葉柄，還是下胚軸，Westar的再生頻率均顯著高于寧油18號和中雙11號，并且子葉柄的再生頻率顯著高于下胚軸。

2.2 苗齡對油菜離體培養再生頻率的影響

選取不同苗齡的子葉柄和下胚軸，在預培養2 d后進行分化培養，研究苗齡對油菜離體培養再生頻率的影響，結果表明，4 d苗齡的子葉柄離體培養再生頻率最高，為70.79%，顯著大于5 d苗齡的再生頻率再生頻率，但與6 d苗齡差異不顯著。苗齡對下胚軸離體培養再生頻率的影響與子葉柄相似，以4 d苗齡的下胚軸再生頻率最高，為58.53%，顯著大于5 d苗齡的再生頻率，但與6 d苗齡的再生頻率差異不顯著（表2）。

2.3 預培養時間對油菜離體培養再生頻率的影響

采用4 d苗齡的油菜子葉柄和下胚軸，在預培養基上預培養1、2、3 d，然后轉入分化培養基，待外植體誘導出芽，分別統計再生頻率。結果表明，預培養時間對子葉柄的離體培養再生頻率的影響不顯著，1～3 d的再生頻率變幅為 62.60%～70.79%。預培養時間對下胚軸的離體培養再生頻率的影響達顯著水平，以預培養2 d效果較好，再生頻率為58.53%，顯著大于3 d的再生頻率，預培養1 d和2 d間差異不顯著（表3）。

2.4 2，4-D濃度對油菜離體培養再生頻率的影響

采用4 d苗齡的外植體，切下子葉柄和下胚軸分別于不同2，4-D濃度的預培養基上預培養2 d，然后轉到芽誘導培養基上進行分化培養，統計再生頻率。結果表明，2，4-D濃度為1.0 mg/L的共培養基對子葉柄再生頻率最高，為7079%，顯著大于0.5 mg/L和1.5 mg/L的濃度；2，4-D濃度對下胚軸再生頻率的影響與子葉柄相同，以1.0 mg/L濃度

最佳，再生頻率為58.53%，顯著高于2，4-D濃度為0.5、1.5 mg/L 的處理（表4），因此，無論是子葉柄還是下胚軸，培養基中2，4-D最適濃度為1.0 mg/L。

2.5 6-BA/NAA對油菜離體培養再生頻率的影響

采用4 d苗齡、2 d預培養的子葉柄和下胚軸，通過固定6-BA 和NAA其中之一的濃度，并調節另一種激素的濃度，形成6-BA/NAA的不同配比，在激素比例不同的分化培養基上進行分化培養，待外植體誘導出芽，統計再生頻率。結果（表5）表明，固定NAA濃度的3個6-BA/NAA配比分化培養基的效果好于固定6-BA濃度的3個配比。在固定NAA濃度時，6-BA/NAA為10 ∶ 1的分化培養基對子葉柄再生頻率最好，為70.79%，顯著大于9 ∶ 1和11 ∶ 1的比例；而下胚軸卻出現相反的結果，6-BA與NAA比例10 ∶ 1時的再生頻率顯著低于其他2個濃度比值，6-BA/NAA比例為9 ∶ 1時，再生頻率達到96.73%。推測在6-BA/NAA為10 ∶ 1時，有利于下胚軸愈傷組織的生長，愈傷組織越長越大，越不利于愈傷組織分化出芽，從而致使再生頻率較低。

3 討論與結論

前人研究結果表明，油菜離體培養再生頻率與品種、外植體類型、苗齡、預培養時間、2，4-D濃度、生長素（NAA）和細胞分裂素（6-BA）的比值都有密切的關系[15-16，21]，本研究是在前人研究的基礎上開展的，試驗中，培養基中其他必要成分，如AgNO3和GA3等的添加均參照其他研究者的經驗[5，13，15]，試驗條件的設定也比對前人的結果。

本研究結果表明，不同油菜基因型的離體培養再生頻率存在顯著差異，Westar的再生頻率顯著大于中雙11號和寧油18號，并且子葉柄的再生頻率普遍高于下胚軸。推測可能由于不同的基因型對愈傷組織的形成產生一定的影響，從而導致再生頻率的差異。子葉柄與下胚軸再生頻率存在差異的原因在于，相對于下胚軸，子葉柄有子葉在培養初期為其提供營養，并且子葉中所含的內源激素對切口處細胞分化與再生具有一定的協調促進作用，子葉柄的切割傷口也遠小于下胚軸，因此子葉柄具有較強的再生能力。研究中筆者還發現，在芽誘導培養過程中，應確保子葉柄插入培養基中而子葉仍保留在培養基的上方，待培養10 d左右，轉到繼代培養基時，再切除子葉，這樣更有利于芽的分化。

苗齡的長短對外植體的再生頻率產生顯著差異，本研究結果表明，苗齡4 d的子葉柄再生頻率最高，與下胚軸得到的結果相似。預培養基中的2，4-D有刺激外植體切口處膨大的作用，研究發現，預培養時間的長短對子葉柄沒有顯著影響，而對下胚軸再生頻率則存在影響，預培養2 d處理的再生頻率顯著大于3 d，與1 d的差異不顯著。苗齡和預培養試驗的結果與杜坤等的結論[5]存在差異。

植物生長調節劑對外植體形成愈傷組織，進而分化成芽具有重要意義[19-20]。在植物離體培養的過程中，植物本身的內源激素水平會不斷發生變化；分化培養基加入的植物生長調節劑（6-BA和NAA）也直接影響和改變著外植體內源激素的水平，而且6-BA與NAA之間也可能相互影響。內源激素和外源激素之間的相互影響，與愈傷組織的形成和芽的誘導具有密切關系[22-24]。本研究表明，子葉柄在6-BA與NAA含量的比值為10 ∶ 1時，其再生頻率顯著大于其他2個水平，而下胚軸的結果卻相反，推測可能是因為該比例不適于下胚軸的分化，上述結果與楊長友等的試驗結果[15]相似，下胚軸對外源激素配比較敏感，當6-BA/NAA為10 ∶ 1時抑制了下胚軸愈傷組織的活性，具體原因還有待進一步研究。

再生芽的誘導過程中，出現大量的玻璃化再生苗，這種再生苗，生長遲緩，葉片厚、呈深綠色，含水量較大，透明或半透明狀，葉片綠化作用小，并且慢慢會黃化，直至死亡，但通過適當處理，可以使玻璃化現象慢慢變弱，最后轉化為正常植株，該方面結果已申請國家發明專利。本研究結果進一步優化了油菜離體培養條件，獲得了最適合的離體培養再生體系，外植體再生頻率最高達到96.73%，顯著高于其他研究結果，為進一步利用轉基因技術獲得預期優良性狀的油菜新種質奠定了基礎。

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