懷牛膝組織培養和快速繁殖體系的優化

劉穎　李冬杰　王沛沛

摘要：為優化懷牛膝（Achyranthes bidentata BL.）組織培養和快速繁殖體系，以懷牛膝莖段作為外植體，選擇MS為基本培養基，研究不同激素配比對組培快繁的影響。結果表明，3種激素對于外植體芽誘導中影響順序依次為6-BA>IBA>KT，最佳芽誘導優化培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。誘導叢生芽增殖的培養基以MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT為最優，增殖系數達6.03。優化生根培養以1/2 MS+0.5 mg/L IBA效果最佳，生根率最高，達95.1%。組培苗移栽至炭灰 ∶ 營養土 ∶ 蛭石（體積比1 ∶ 2 ∶ 1）的基質中，成活率達到100%，且植株生長健壯。

關鍵詞：懷牛膝；組織培養；快速繁殖；優化

中圖分類號： Q945.5；S567.23+9.043 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0083-04

懷牛膝（Achyranthes bidentata BL.）屬莧科牛膝屬多年生草本植物，高70～120 cm，生長于河南沁陽、武陟、修武、溫縣一帶，為中國著名的“四大懷藥”之一[1]。其根呈圓柱形，直徑5～10 mm，土黃色；莖有棱角或四方形，綠色，有的還帶有紫色；葉片一般是橢圓形或是橢圓披針形，基部呈楔形或是寬楔形。懷牛膝因其根含皂苷元、齊墩果酸、蛻皮激素、牛膝多糖等有效成分，具有補肝腎、強筋骨、通血脈、降血壓、鎮痛、引藥下行和瀉濁通淋等功效[2]，所以越來越受到人們的青睞，具有廣闊的開發利用前景。為了滿足市場需求，須要對其進行大規模的培養栽培。近年來，對于牛膝的組織培養研究也有相關報道[3-5]，但對于外植體選擇、激素配比及叢生芽分化上還存在一些問題[6-7]。本研究選取懷牛膝莖段為外植體，建立并優化懷牛膝的組織培養及快繁體系，以期獲得最佳的組培條件，整體提高懷牛膝組培的效率，為其藥用成分的長期工廠化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料由河北科技大學植物組織培養實驗室提供，以含有1～2個芽眼的懷牛膝2 cm幼嫩莖段為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理 選取懷牛膝2 cm帶腋芽莖段，先用去離子水沖洗，再加入稀釋的洗潔精清洗，之后置于超凈工作臺上。用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3次，然后用0.1%氯化汞消毒3 min，最后用無菌水沖洗3次，用消毒濾紙吸干水分，在無菌條件下，把消毒后的莖段切成0.5 cm 的小段待接種。

1.2.2 芽誘導培養基的優化 以MS為基本培養基（蔗糖3%、瓊脂0.8%，pH值為5.7～5.8），添加不同濃度的6-BA、IBA、KT，采用L9（34）正交設計表（表1），以篩選出最佳的激素組合，確定最佳的誘導培養基。將消毒處理后的外植體置于誘導培養基上，每種培養基中接種3個，重復3次，置于培養室中，進行培養并定期觀察不同外植體的誘導及分化情況，14 d后統計每個外植體誘導出的叢生芽數。

1.2.3 叢生芽增殖培養基的優化 以MS為基本培養基（蔗糖3%、瓊脂0.8%，pH值為5.7～5.8），添加IBA 0.5 mg/L、KT 0.2 mg/L及3種不同濃度梯度的6-BA（表2），以篩選出最佳的6-BA濃度，確定最優的增殖培養基。切取1 cm長的單芽接種至3種增殖培養基上，每種培養基接種30個，置于培養室中進行增殖培養，觀察叢生芽增殖及生長情況，25 d后統計叢生芽的增殖系數（增殖系數=叢生芽分化的個數/叢生芽分化的外植體數）。

1.2.4 生根培養基的優化 切取生長較粗壯的叢生芽接種于1/2 MS培養基 （蔗糖3%、瓊脂0.8%，pH值5.7～5.8） 上，并添加不同濃度的激素 （表3）進行生根誘導培養，每種培養基接種約30個叢生芽。觀察根的萌發及生長情況，統計根長、生根數和生根率（生根率=生根的組培苗數/接種的組培苗數×100%）。

1.2.5 培養條件 培養室的溫度為（25±2） ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為14 h/d。

1.2.6 練苗與移栽的優化 當生根苗長至5 cm時，置于溫室中揭去瓶蓋練苗4 d。然后用鑷子取出小植株，流水洗凈根部附著的培養基，移栽至苗床上，苗床基質采用4種處理，分別為（1）草炭土；（2）營養土；（3）草炭土+營養土+蛭石（體積比1 ∶ 2 ∶ 1）；（4）營養土+蛭石（體積比2 ∶ 1）。將移栽苗置于相對濕度80%～90%、溫度（25±2） ℃的環境中遮陰培養。培養期間，用1/2 MS的大量元素的營養液潤濕基質，觀察懷牛膝苗的生長情況，30 d后統計成活率，并比較生長狀態。

1.3 數據統計

利用SPSS 20.0軟件統計分析數據。

2 結果與分析

2.1 外植體芽誘導的優化

將處理后的懷牛膝帶芽莖段分別接種于不同激素濃度組合的誘導培養基中，在相同條件下進行離體培養，比較不同激素濃度配比對外植體芽誘導的影響，正交試驗結果見表4，方差分析結果見表5。

從表4可以看出，試驗中選取的3種激素，即6-BA、IBA、KT對懷牛膝外植體的誘導均具有影響。通過極差分析得出，3種激素對于叢生芽誘導的影響從強到弱依次為 6-BA>IBA>KT，3種激素最優水平的組合是A2B1C2。方差分析結果表明，3種影響因素的不同水平之間均存在極顯著差異，3種激素的不同濃度配比對外植體的誘導具有極顯著的影響。

在9種不同濃度的激素組合培養基中外植體芽的誘導和生長情況不同（表4、圖1）。接種在4號培養基中的外植體出芽數最高，平均達到3.25；4號培養基中外植體芽的生長狀態最好。培養7 d后，9種培養基中的外植體均于切口處萌發側芽，使其出現了啟動現象。但隨著培養時間的延長，不同培養基中的外植體芽生長情況出現了差異。5號、6號培養基中莖段基部愈傷組織生長旺盛，叢生芽數量少，而4號培養基中莖段的腋芽著生處膨大變綠，在切口處形成少量的綠色愈傷組織；并在莖節或莖尖端緊靠莖節上、下的部位分化出側芽，且生長旺盛；14 d形成叢生芽。

結合正交試驗分析結果及外植體芽誘導和生長情況，4號培養基的激素濃度配比為1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT，為懷牛膝外植體芽誘導的最佳激素配比方案。

2.2 叢生芽增殖的優化

正交試驗結果表明，影響懷牛膝叢生芽誘導分化的主要因素是6-BA，試驗設計了6-BA 3個不同濃度梯度的增殖培養基。將懷牛膝單芽接種至3種不同的增殖培養基中，觀察叢生芽的增殖及生長情況，培養30 d后統計叢生芽的增殖

系數及株高，比較不同6-BA濃度對叢生芽增殖的影響（表6）。結果表明，在Z2培養基中，即添加1.3 mg/L 6-BA時，叢生芽的增殖系數最高，平均為6.03，叢生芽生長最快，且植株總體生長狀況最佳，整體表現均勻、壯實，植株株高達4.12 cm（圖2）。培養基6-BA濃度增加1.5 mg/L或濃度減少至1.0 mg/L，叢生芽增殖系數和株高均偏低，且3種不同濃度的6-BA誘導叢生芽增殖的效果差異顯著。牛膝叢生芽增殖最適的6-BA濃度為1.3 mg/L，最優的增殖培養基為Z2，即MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。

2.3 誘導生根的優化

選取生長健壯且長勢一致、高3～5 cm的叢生芽接入4種不同生根培養基中進行生根誘導。7 d可見根已長出，11 d根長可達約5 cm，根數最多達到8條，單芽長高變大，逐漸長成苗。從表7可以看出，在1/2 MS培養基中添加一定濃度的NAA或IBA都可以誘導懷牛膝叢生芽生根，但不同激素種類和濃度對生根誘導的影響不同（圖3）。多重比較分析結果顯示，4種不同生根培養基中叢生芽的根長、平均生根數、生根率均存在顯著差異。整體來看，在添加NAA的G1、G2培養基中，懷牛膝叢生芽生根速度慢，根粗且短，生根率低；而在添加IBA的G3、G4培養基中，叢生芽生根速度較快，生根率較高。在G4培養基中生根效果最好，生根率最高，為95.1%，并且生根速度快，根多而長，粗細適中。所以，懷牛膝叢生芽誘導生根的最佳培養基為G4培養基，即1/2 MS+0.5 mg/L IBA。

2.4 組培苗練苗移栽的優化

懷牛膝生根苗經過練苗4 d后移栽至4種基質中，比較在不同的基質中組培苗的生長情況，結果（表8）表明，懷牛膝的生根苗移栽至草炭灰 ∶ 營養土 ∶ 蛭石（體積比1 ∶ 2 ∶ 1）的基質中成活率最高，達100%，且15 d后幼苗長出新葉（圖4），植株壯實。

3 結論與討論

植物生長調節物質對植物細胞的分裂、分化產生影響。一定濃度配比的細胞分裂素和生長素對叢生芽的誘導與增殖發揮著重要作用。不同激素濃度組合的正交試驗及極差分析結果表明，3種激素對于叢生芽誘導的影響從強到弱依次為6-BA>IBA>KT，3種激素最優水平的組合是A2B1C2。以此激素組合的培養基誘導懷牛膝外植體出芽數最多，平均值達3.25，并且外植體芽生長健壯、長勢好，綜合正交試驗結果和外植體芽的誘導分化，篩選出懷牛膝外植體芽誘導的最佳培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。結果表明，細胞分裂素6-BA在叢生芽誘導中最為重要，它可以促進細胞分裂，使芽分化，促進萌發[8]，特別是與一定濃度的生長素協同作用時會加速細胞分裂，加快叢生芽分化生長的速度。增加6-BA濃度，外植體的出芽數會增加，但當6-BA濃度達到1.5 mg/L時，外植體的出芽數呈減少的趨勢，外植體芽的誘導受到了抑制，本結論與劉堅等的研究結果[9]一致，可能與試驗材料自身生理特性及細胞分裂素和生長素的交互作用有關[10]。在叢生芽增殖誘導中，設計6-BA的3個濃度梯度[11]，獲得最佳的增殖培養基為MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT，增殖系數最高達6.03。

生根過程起始于莖內已分化潛伏的根原基，研究表明，生長素IBA和NAA對根的形成均發揮著重要作用。IBA可以促進根原基的產生，激活不定根[12]，加快不定根生長的速度，且形成的不定根細而長，在根與莖之間連接緊密，有利于組培苗大范圍吸收營養及水分。而NAA作用機理主要是為根的形成提供能源和碳源。通過不同濃度IBA、NAA的對比試驗發現，IBA在生根速度、生根條數及生根率上均優于NAA。生根培養以培養基1/2 MS+0.5 mg/L IBA效果最佳，生根率最高，達95.1%，且每株組培苗平均生根數約為8條。

栽培基質是組培苗移栽成活的基礎，在保水性能好且通風透氣的栽培基質中，組培苗成活率較高[13]。通過不同基質的配比試驗得出練苗后置于草炭灰 ∶ 營養土 ∶ 蛭石（體積比1 ∶ 2 ∶ 1）的基質中，組培苗成活率可以達到100%，且植株生長健壯。

本研究從外植體芽誘導、叢生芽增殖、叢生芽生根、組培苗練苗移栽4個階段優化懷牛膝組織培養和快速繁殖體系，整體提高組培效率，為實現懷牛膝工廠化快速繁育奠定基礎。

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