信陽地區水稻資源的遺傳多樣性分析

龐瑞華　王玲　李小寧

摘要：以信陽稻區水稻育種的主要親本為試驗材料，利用RAPD分子標記技術對其遺傳多樣性進行分析。結果表明，篩選出的17條多態性引物在43份水稻材料中共有126個位點條帶，其中多態性條帶有118條，其多態性比率為93.6%；每個引物可擴增出3～8條多態性條帶，平均產生多態性條帶5.5條。43個品種（品系）間遺傳相似系數變化范圍為0.402～0.937。基于RAPD標記，利用NTSYS.pc2.11構建了聚類樹狀圖譜，遺傳距離為0.68，將43 份水稻資源聚成4大類群。該研究為信陽水稻種質資源的鑒定及水稻新品種的選育等方面提供重要依據。

關鍵詞：水稻；種質資源；RAPD；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號： S511.032 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0113-03

水稻是人類最重要的糧食作物之一，世界上超過一半的人口以其為主食[1]。 河南省信陽稻區常年種植水稻面積在 43.3萬hm2 以上，約占全省水稻種植面積的70%，是河南水稻的主產區。目前，對信陽地區水稻的研究主要集中在高產栽培及病蟲害防治方面[2-4]，而對水稻種質資源分子遺傳多樣性的研究非常薄弱。水稻種質資源是水稻育種的基礎，充分了解和掌握當地資源的豐度、差異性、親緣關系等是培育水稻品種的必要條件。隨機擴增多態性DNA （RAPD） 技術于1990年由美國Williams首先報道[5]，該技術是建立在PCR基礎上的一種可對整個未知序列的基因進行多態性分析的分子技術。由于具有DNA用量少、靈敏度高、快捷、檢測容易和標記的數量多等優點，已被廣泛應用于評價水稻種質的遺傳多樣性和親緣關系[6-9]。

對現有材料進行遺傳多樣性研究，可有效減少相似遺傳背景的組合，減少育種的工作量，對于親本的雜交組合配置具有重要的指導意義[10]。本研究擬以信陽稻區保存的43份水稻親本為試驗材料，選用40條RAPD 隨機引物對供試材料擴增，旨在從DNA分子水平上探討這些材料之間的遺傳多樣性程度，從而為信陽地區水稻育種實踐提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的水稻種質43份，包括42份常規粳稻和1份常規秈稻；有7份審定品種，其他36份為中間育種材料。材料編號、名稱及來源見表1。材料均由信陽農林學院水稻研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻基因組DNA的提取 將收集的水稻種子在實驗室中發苗，然后取幼嫩的新鮮葉片，采用CTAB （十六烷基三甲基溴化銨）法提取葉片基因組 DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2 RAPD引物的篩選 選出40條10個堿基長度的寡核苷酸隨機引物[6-7]，委托江蘇南京金斯瑞生物科技公司合成。對上述提取后的樣本基因組DNA進行RAPD 預擴增，從中篩選出多態性高、條帶清晰和重復性好的引物。

1.2.3 RAPD反應體系及擴增程序 反應體系包括10 μL 2×Power Taq PCR Master Mix（北京百泰克生物技術有限公司，內含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2以及反應緩沖液等），20～50 ng DNA模板，1 μL（10 mmol/L）引物，補雙蒸水至總體積20 μL。擴增程序如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，36 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，45個循環；72 ℃延伸5 min。采用1.5%的瓊脂糖凝膠（加入Gold View I型核酸染色劑）電泳檢測PCR擴增產物。

1.2.4 數據的統計與分析 DNA圖譜中，在同一遷移位置，有DNA擴增帶的量化為1，無擴增帶的量化為0，列出二元數據矩陣。應用NTSYSpc2.10e統計分析軟件計算品種間的遺傳相似系數（genetic similarity，GS），根據遺傳相似系數的數據集，采用UPGMA（非加權配對算術平均法）構建遺傳關系樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 RAPD標記結果分析

從50條引物當中篩選出了17條擴增穩定、多態性豐富的引物（表2）。所有的材料共擴增出126條帶，其中多態性條帶118條，占總擴增片段的93.6%。每個引物可擴增出 3～11條多態性條帶，平均產生多態性條帶6.9條（圖1）。由表2可知，擴增位點最少的引物是Rp16，僅有3個擴增位點。圖1顯示17條引物在43個水稻品種中的多態性比率均高于80%，可用于水稻種質資源的品種鑒定及親緣關系分析。如圖1是利用引物Rp15 得到的部分材料的RAPD標記圖譜。

2.2 不同材料間的遺傳相似性分析

根據17條引物在43份供試材料中所獲得的126條擴增條帶，應用NTSYSpc2.10軟件包計算供試品種間的遺傳相似系數。所有供試品種間的遺傳相似系數變化范圍為0.402～0.937，材料間表現出顯著的遺傳變異。淮稻12與長香粳之間的遺傳相似系數（GS=0.402）最小，反應出兩者的遺傳異質性較大；P078和黃金晴之間的遺傳系數高達0.937，表明這2個材料間的遺傳相似性較大；香寶3號（表1中編號為5）秈稻與大部分供試品種具有很大的差異性，遺傳相似系數在04～0.7之間。

2.3 聚類分析

由圖2可知，當以遺傳相似系數0.68為閾值時，43份常規稻材料可以分為四大類。第Ⅰ類包含24份材料。以遺傳相似系數0.73為閾值，24份材料可分為2個亞組，分別以Ⅰ-1、Ⅰ-2表示。Ⅰ-1組包括香粳33等23個品種，由表1可知，這23個品種均為粳稻，且來源地大多為河南信陽。Ⅰ-2組類僅包括1份材料：黑香糯192（編號為25），米粒黑色，為常規粳稻。第Ⅱ類中只有香寶3號（編號為5）1份材料，為常規秈稻。第Ⅲ類包括武香粳等16個品種。第Ⅳ類包括2份材料：伊拉泰104（編號為28）和津稻293（編號為29）。

3 討論

3.1 水稻材料間遺傳多樣性

本研究對43份水稻材料的遺傳多樣性分析中，17個引物共擴增出126條帶，其中多態性條帶118條，多態性程度達到約93.6%，遠高于49份旱稻（81.6%）[6]和貴州19份水稻（84%）[7]的遺傳多樣性。如此高的遺傳多態性，一方面與本研究材料的來源地廣泛有關：不僅有國內，還有國外材料，40份常規稻來自于國內4個省（河南、江蘇、天津和安徽），其余3份常規稻分別來源于法國、美國和日本；另一方面和材料的性狀類型豐富有關：試驗材料除了普通常規稻外，還有旱稻、

香稻和黑稻等材料。從多態性比例看，本研究的43份材料存在著較大的遺傳差異和豐富的遺傳多樣性，這正是進行雜交育種可利用的遺傳資源。

3.2 43份水稻材料的聚類分析

本試驗的聚類結果基本反應了材料間的系譜關系。當以遺傳相似系數0.69為閾值，43份常規稻親本材料可以分為4大類，其中香寶3號（5號）單獨聚為一類，原因是42份材料均為粳稻，而5號為秈稻。這與王英等利用RAPD對49份旱稻種質的的聚類結果[6]相一致。同一單位的育成品種遺傳差異較小，容易歸為一類[11]；來自信陽農林學院的10份水稻聚到第Ⅰ類，4份材料聚到了第Ⅲ類。本研究材料中共有17份香稻，其中16份聚到第一大類，表明這些香稻具有一致的遺傳背景和起源。然而，白現廣等對云南的 10個香稻品種、45個非香稻地方栽培品種利用SSR進行聚類，發現10個香稻品種并沒有聚在一起[12]，這與云南現有的香稻栽培品種并非為單一的遺傳來源，而是從多個祖先分別起源有關。

RAPD標記是從分子水平上揭示種質間的遺傳差異，比傳統的遺傳標記準確度要高，因此本研究采用RAPD技術分析43份水稻材料的遺傳多樣性。近年來，隨著水稻基因組測序的完成，另一種分子標記技術簡單重復序列SSR正被廣泛應用于水稻遺傳多樣性的研究中[13-15]。分類收集更多的信陽水稻種質，結合不同的分子標記方法和農藝性狀對其進行多樣性分析將是下一步研究的內容。

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