青花菜花球及葉片中硫代葡萄糖苷組分及含量分析

馬越　丁云花　劉光敏

摘要：對(duì)12個(gè)青花菜（Brassica oleracea L. var. botryti L.）品種的花球及葉片中的硫苷含量及組成進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)果表明，青花菜中含有9種硫代葡萄糖苷，分別為3-甲基硫氧烯丙基硫苷（IBE）、2-羥基-3-丁烯基硫苷（PRO）、2-丙烯基硫苷（SIN）、4-甲硫基-3-丁烯基硫苷（RAA）、3-丁烯基硫苷（NAP）、4-羥基吲哚基-3-甲基硫苷（4OH）、3-甲基吲哚基硫苷（GBC）、4-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（4ME）、1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（NEO）。青花菜花球中的硫苷含量是葉片中的1～5倍不等，不同品種之間存在差異性。RAA是青花菜中含量最多的硫苷組分。

關(guān)鍵詞：青花菜；花球；葉片；硫代葡萄糖苷

中圖分類號(hào)： S635.301 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0300-04

青花菜（Brassica oleracea L. var. botryti L.）屬于十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的變種，為一、二年生草本植物。硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GLS，簡(jiǎn)稱硫苷）是一類含硫化合物，是十字花科蔬菜中重要的次生代謝產(chǎn)物。所有的十字花科植物都能夠合成硫代葡萄糖苷，硫代葡萄糖苷存在于這些植物的根、莖、葉、種子中[1]。由于側(cè)鏈R 基團(tuán)的不同，可把硫苷分為脂肪類、芳香類、吲哚類硫苷3類。硫代葡萄糖苷及其降解產(chǎn)物具有多種生物活性、化學(xué)活性，硫代葡萄糖苷已被證實(shí)與十字花科蔬菜的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)成分、植物自我保護(hù)機(jī)制以及人類的身體健康有著密切關(guān)系。蔬菜在被食用或機(jī)械破碎時(shí)，其中所含的硫苷被內(nèi)源芥子酶水解成多種具有生理活性的降解產(chǎn)物，產(chǎn)物之一的異硫氰酸酯能夠有效預(yù)防癌癥，尤其是膀胱癌、結(jié)腸癌和肺癌[2-4]。青花菜富含3-甲基硫氧烯丙基硫苷（glucoiberin）、4-甲基硫氧丁基硫苷（glucoraphanin）、3-甲基吲哚基硫苷（glucobrassicin）以及1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（neoglucobrassicin）[5]。英國(guó)科學(xué)家已選育出高硫苷含量的青花菜新品種，該品種的抗癌能力是普通青花菜的80 倍[4，6]。不同蔬菜種類或同一蔬菜種類的不同品種、不同生長(zhǎng)環(huán)境以及同一植株的不同生長(zhǎng)階段、同一植株的不同部位硫苷的含量及組分都存在差別[7-10]。本研究對(duì)我國(guó)市場(chǎng)上常見的12個(gè)青花菜品種的花球、葉片的硫苷含量及組成進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)合青花菜栽培性狀及產(chǎn)量等進(jìn)行分析，旨在對(duì)青花菜育種及副產(chǎn)物綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的12個(gè)青花菜品種來(lái)自北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心（表1）。2013年2月1日播種，3月25日定植于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心通州農(nóng)場(chǎng)，采用露地直播方式，株距50 cm，行距 50 cm，重復(fù)3 次。7月24日取新鮮的花球及葉片測(cè)定硫苷含量。

1.2 方法

1.2.1 硫苷的提取[11] 取新鮮青花菜花球及葉片，分割成小球或小片，在真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥。稱量粉碎好的樣品0.2 g，放入15 mL塑料管中。加入內(nèi)標(biāo)TRO（苯甲基硫苷）0.25 mL，迅速加入100%預(yù)熱的甲醇，80 ℃下水浴20 min，每隔4～5 min渦旋振蕩1次，3 000 r/min離心10 min，取上清液倒入15 mL塑料管中，放在冰盆中。沉淀物繼續(xù)用70%甲醇提取2次，同上述處理方法，合并上清液，即為樣品液。取一次性注射器，加入玻璃棉，塞緊，放在試管上。加入DEAE膠溶液2 mL，用2 mL雙蒸水洗滌，加入樣品液2 mL。待樣品液不再滴下，加入0.02 mol/L NaAc溶液。待不再有液體滴下，將注射器轉(zhuǎn)移到另一試管上，加入75 μL硫酸酯酶溶液，封口過(guò)夜。將過(guò)夜的注射器用雙蒸水洗滌3次，每次 0.5 mL。用注射頭擠壓注射器，使液體盡可能轉(zhuǎn)移到試管中。將試管中液體通過(guò)0.45 μm濾膜轉(zhuǎn)移到小玻璃瓶中，冷凍保存，待用。

1.2.2 硫苷的分析 HPLC分析條件：Nova-Pak C18色譜柱：3.9 mm×150 mm，50 μm，檢測(cè)波長(zhǎng)229 nm，流速 1.0 mL/min，常溫，進(jìn)樣量20 μL，梯度洗脫如表2所示。A液：1 g四甲基氯化銨（TMACl）溶于2 L雙蒸水中，混勻，抽濾。B液：1 g四甲基氯化銨（TMACl）溶于1.6 L雙蒸水中，加入400 mL色譜純乙腈，混勻抽濾。

采用苯甲基硫苷作為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)保留時(shí)間和峰面積測(cè)定硫苷組分。利用內(nèi)標(biāo)和響應(yīng)因子計(jì)算硫苷含量，硫苷含量計(jì)算公式如下：

硫苷含量=脫硫硫苷峰面積×內(nèi)標(biāo)量×脫硫硫苷相對(duì)響應(yīng)因子內(nèi)標(biāo)峰面積×試樣質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 青花菜中硫苷組分

根據(jù)不同保留時(shí)間以及特征峰形，可以鑒定得到：3-甲基硫氧烯丙基硫苷（glucoiberin，IBE）、2-羥基-3-丁烯基硫苷（progoitrin，PRO）、2-丙烯基硫苷（sinigrin，SIN）、4-甲基硫氧丁基硫苷（glucoraphanin，RAA）、3-丁烯基硫苷（gluconapin，NAP）、4-羥基吲哚基-3-甲基硫苷（4-hydroxyglucobrassicin，4OH）、苯甲基硫苷（glucotropaeolin，TRO，內(nèi)標(biāo)）、3-甲基吲哚基硫苷（glucobrassicin，GBC）、4-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（4-methoxyglucobrassicin，4ME）、1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（neoglucobrassicin，NEO）（圖1）。

2.2 不同青花菜品種中總硫苷含量

由圖2可以看出，不同青花菜品種間花球及葉片中總硫苷含量差異較大。青花菜花球中，中綠1號(hào)的硫苷含量最高，為23.53 μmol/g DW；其次是貢獻(xiàn)者，含量為 23.03 μmol/g DW；含量最低的是大帝，為9.19 μmol/g DW。青花菜葉片中，中綠9號(hào)總硫苷含量最高，為 10.11 μmol/g DW；其次為中綠5號(hào)，為9.86 μmol/g DW；含量最低的是南秀366號(hào)，僅為1.93 μmol/g DW。總體而言，青花菜花球中的硫苷含量是葉片的1～5倍不等，不同品種之間存在差異性。

2.3 不同青花菜品種中硫苷組分的分析

目前已從自然界中分離鑒定出120多種硫苷，不同十字花科作物中的硫苷組分不同，其中在蕓薹屬蔬菜中發(fā)現(xiàn)了 15～20種硫苷[12]，青花菜中已報(bào)道的則有16種[5]。本試驗(yàn)對(duì)12 個(gè)青花菜品種的花球和葉片中的硫苷組分進(jìn)行了測(cè)定，共檢測(cè)出9種硫苷組分（表3、表4）。這9 種硫苷分屬于脂肪類、吲哚類，沒(méi)有檢測(cè)出芳香類硫苷。

由表3可以看出，9種硫苷組分中，RAA在青花菜花球中含量最多，占硫苷總含量的20.14%～69.42%。南秀366號(hào)總硫苷含量為13.31 μmol/g，但RAA含量為9.24 μmol/g，在所有品種中占比最高。野綠總硫苷含量為21.55 μmol/g，但其中RAA僅為4.34 μmol/g，僅占總含量的20.14%。結(jié)果表明，不同青花菜栽培種對(duì)RAA硫苷在總硫苷含量中所占的比例有影響，這與Schonhof等的檢測(cè)結(jié)果[13]一致。Abercrombie等研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)2年青花菜雙單倍體（自交種）親本形成的雙列雜交群體中，RAA含量呈現(xiàn)顯著的常規(guī)遺傳結(jié)合力，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的特殊遺傳結(jié)合力，常規(guī)遺傳結(jié)合力均方約為特殊遺傳結(jié)合力均方的14倍，表明常規(guī)結(jié)合力在預(yù)測(cè)雜交產(chǎn)生的RAA含量方面比特殊結(jié)合力更重要，因此一個(gè)給定的自交種與其他自交種結(jié)合將產(chǎn)生相對(duì)可預(yù)測(cè)RAA含量的雜交種[14]。青花菜花球是主要的可食部位，因此，青花菜潛在的保健作用主要取決于所選擇的栽培品種。

由表4可以看出，RAA在青花菜葉片硫苷組分中占比最高，占總含量的9.33%～56.57%，其中中綠6號(hào)總硫苷含量9.25 μmol/g DW，RAA含量為4.76 μmol/g DW；南秀366號(hào)總硫苷含量為所有品種中最低，僅為1.93 μmol/g DW，其中RAA占比也最低。葉片的用途與花球不同，葉片是青花菜的副產(chǎn)物，可以作為飼料進(jìn)行再利用。研究表明，含有β-OH的硫代葡萄糖苷能降解生成2種能導(dǎo)致甲狀腺腫大的產(chǎn)物：異硫氰酸鹽和唑烷-2-硫，它們通過(guò)不同的方式作用于動(dòng)物或人體的甲狀腺造成危害[3-4]。PRO是對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不利的主要硫苷組分[15]。從表4可以看出，PRO占總硫苷含量從1189%～42.83%不等，其中幸運(yùn)品種PRO含量為0.88 μmol/g DW，硫苷總含量為7.4 μmol/g DW，幸運(yùn)品種的葉片最適宜進(jìn)行飼料加工。

青花菜是十字花科蔬菜中4-甲硫基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷（glucoraphanin，RAA）含量最豐富的蔬菜之一[16]。RAA是蘿卜硫素前體，蘿卜硫素已被證實(shí)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的phaseⅡ酶誘導(dǎo)劑，能降低食道癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種癌癥的發(fā)病率[2-5，17-19]。其他硫苷的同源異硫氰酸鹽的抗癌功效也有報(bào)道，如 3-甲基吲哚基硫苷（glucobrassicin，GBC）的水解產(chǎn)物吲哚-3-甲醇能夠調(diào)節(jié)生物轉(zhuǎn)化酶的活性，從而抑制乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞的活性[20-21]。

不同蔬菜和品種中硫苷含量的差異可以歸結(jié)為基因型不同[22]，同時(shí)受環(huán)境因素的影響。Farnham等對(duì)生長(zhǎng)在3個(gè)不同環(huán)境下的9種不同基因型的青花菜硫苷含量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)環(huán)境對(duì)硫苷含量影響顯著，RAA是唯一顯著受基因型影響的硫苷，對(duì)RAA含量的影響因素中，基因型效應(yīng)占528%，基因型和環(huán)境互作效應(yīng)小于基因型[10]。本試驗(yàn)中所有青花菜品種均生長(zhǎng)在同一環(huán)境中，栽培條件基本相同，因此硫苷含量差異主要取決于品種本身基因差異。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，青花菜中檢測(cè)到9種硫代葡萄糖苷，分別為3-甲基硫氧烯丙基硫苷（IBE）、2-羥基-3-丁烯基硫苷（PRO）、2-丙烯基硫苷（SIN）、4-甲硫基-3-丁烯基硫苷（RAA）、3-丁烯基硫苷（NAP）、4-羥基吲哚基-3-甲基硫苷（4OH）、3-甲基吲哚基硫苷（GBC）、4-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（4ME）、1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（NEO）。這9種硫苷分屬于吲哚類與脂肪類，沒(méi)有檢測(cè)到芳香類硫苷。其中4-甲硫基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷是青花菜中的主要硫苷。南秀366號(hào)花球中RAA含量占比最高，葉片中RAA含量占比最低，具有潛在的應(yīng)用前景。

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