響應面法優(yōu)化亞臨界水提取銀耳多糖工藝研究

高麗萍　鄭光耀　閆林林

摘要：采用亞臨界水提取技術提取銀耳多糖，考察提取溫度、提取時間、液料比對多糖提取得率的影響，結合響應面法優(yōu)化其提取工藝，并與傳統(tǒng)熱水浸提法進行比較。結果表明，亞臨界水提取銀耳多糖的最佳工藝條件為提取溫度138 ℃、提取時間30 min、液料比30 mL/g，在該條件下銀耳多糖提取得率可達34.58%。與傳統(tǒng)熱水浸提法相比，銀耳多糖的提取得率提高了84.23%，亞臨界水提取法可明顯縮短銀耳多糖的提取時間和提高銀耳多糖的提取得率。

關鍵詞：銀耳；多糖；亞臨界水提取；響應面法優(yōu)化

中圖分類號： TS201.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0339-04

銀耳是一種經(jīng)濟價值高、營養(yǎng)豐富的藥食兩用菌，具有潤肺生津、滋陰養(yǎng)胃、補腦強心等功效。我國是銀耳生產(chǎn)大國，但目前市場上銷售的銀耳品種單一，絕大部分是未經(jīng)任何加工的銀耳干品，在一定程度上限制了銀耳的消費。銀耳多糖是銀耳的主要活性成分，具有提高機體免疫能力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗?jié)儭⒖寡ㄐ纬伞⒖雇蛔兊茸饔茫蓮V泛應用于功能性食品、醫(yī)藥保健品及日用化妝品等領域[1-4]。銀耳多糖的常用提取方法是熱水浸提法，但這種傳統(tǒng)的提取方法存在耗時長、提取率低、易造成資源浪費等問題。銀耳多糖分為胞外多糖和胞壁多糖，其中胞壁多糖存在于細胞壁內部，用熱水浸提很難提取完全，即使是采用稀酸提取法或稀堿提取法，又由于部分多糖易發(fā)生水解，破壞多糖的活性結構，導致多糖損失和提取率降低。亞臨界水提取技術是近年來發(fā)展起來的一種新興的提取技術，具有提取時間短、提取效率高、環(huán)境友好等技術優(yōu)勢，是一種很有開發(fā)潛力的綠色提取技術[5-7]。本研究采用亞臨界水提取銀耳多糖，研究提取溫度、提取時間、液料比對銀耳多糖提取得率的影響，并結合響應面分析法優(yōu)化銀耳多糖的亞臨界水提取工藝，提高銀耳多糖的提取得率，旨在為銀耳多糖的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

市購干燥的銀耳子實體，經(jīng)萬能粉碎機粉碎后，得到過40目篩的銀耳粉末，備用。葡萄糖標準品；苯酚、濃硫酸均為分析純；去離子水；UV-2102 PC型紫外-可見分光光度計；TGL-16C型高速臺式離心機。自制亞臨界水萃取裝置，如圖1所示。

1.2 方法

1.2.1 亞臨界水提取 稱取一定量的銀耳粉末置于萃取罐的物料籃內，在不同提取溫度、提取時間、液料比的條件下進行提取，亞臨界水提液4 000 r/min離心10 min，測量上清液體積，測定銀耳多糖含量，計算銀耳多糖得率。

1.2.2 熱水回流提取 稱取一定量的銀耳粉末置于圓底燒瓶內，按液料比60 mL/g加入去離子水，在100 ℃水浴鍋回流提取6 h，提取液在4 000 r/min離心10 min，取上清液，測定銀耳多糖含量，計算銀耳多糖得率。

1.2.3 多糖標準曲線制作 0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液：將葡萄糖干燥至恒質量后準確稱取1.000 g，用去離子水溶解并定容至1 L，梯度稀釋至0.1 mg/mL。分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL葡萄糖標準溶液于20 mL比色管中，用去離子水補至2.0 mL；混合均勻后分別依次加入5%苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0 mL，搖勻；靜置10 min放入沸水浴中反應15 min，水浴冷卻至室溫，490 nm處進行測量，以吸光度為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 多糖測定和計算方法 參考苯酚-硫酸法[8]測定多糖含量：準確吸取樣品液1.0 mL，加水補充至2.0 mL，搖勻，加入5%苯酚1.0 mL，搖勻，再加5.0 mL濃硫酸，迅速搖勻。室溫放置5 min，在沸水浴中保溫15 min，用自來水冷卻 5 min，再搖勻，于波長490 nm處測定吸光度。多糖得率計算公式如下：

粗多塘得率=C×V1×N×10-3V2×m×100%

式中：C表示經(jīng)過稀釋后測定的多糖含量（μg）；V1表示提取后得到的上清體積（mL）；N表示稀釋倍數(shù)；V2表示用于測定的上清體積（mL）；m表示用于提取的銀耳質量（mg）。

1.2.5 響應優(yōu)化法試驗設計 在提取溫度、提取時間、液料比3個單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用三因素三水平響應面分析法，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因子，以多糖提取得率為響應值作響應面與等值線圖，分析優(yōu)化最佳提取條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

根據(jù)文獻報道，在亞臨界水提取過程中，壓力只是用來使水保持液體狀態(tài)[9]，所以本試驗不考慮壓力對多糖得率的影響，選擇3 MPa作為提取壓力，研究提取溫度、提取時間、液料比3個因素對銀耳多糖提取得率的影響。

2.1.1 提取溫度的影響 在提取時間為20 min，液料比為60 mL/g的條件下，選取提取溫度分別為100、110、120、130、140、150 ℃，對銀耳多糖進行亞臨界水提取。由圖2可知，隨著提取溫度的升高，多糖得率逐漸升高，100～130 ℃升高趨勢明顯，到達130 ℃后再提高溫度，多糖得率有下降趨勢。因此，選取130 ℃作為后續(xù)的亞臨界水提取溫度。

2.1.2 提取時間的影響 在提取溫度為130 ℃，液料比為60 mL/g條件下，選取提取時間分別為10、20、30、40、50 min對銀耳多糖進行亞臨界水提取。由圖3可知，在10～20 min內，多糖得率會隨著提取時間的延長而增加，繼續(xù)延長提取時間，多糖得率變化并不明顯。因此，選取20 min作為后續(xù)的亞臨界水提取時間。

2.1.3 液料比的影響 在提取溫度130 ℃，提取時間20 min條件下，選擇液料比為20、30、40、50、60 mL/g對銀耳多糖進行亞臨界水提取。由圖4可知，多糖得率隨液料比的增大而增加，當液料比在20～40 mL/g之間時，多糖得率增加較快，繼續(xù)提高液料比多糖得率并沒有增加。因此，選取40 mL/g作為后續(xù)的亞臨界水提取液料比。

2.2 響應面分析法優(yōu)化工藝

2.2.1 多糖提取試驗方案和因素水平 響應面分析法已經(jīng)被廣泛應用于化學化工、生物工程、食品工業(yè)等領域[10]。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，選取提取溫度、提取時間、液料比對銀耳多糖亞臨界水提取得率影響顯著的3個因素，采用三因素三水平響應面分析方法進行試驗設計（表1）。

2.2.2 響應面分析方案及結果 對銀耳多糖亞臨界水提取工藝進行響應面分析，具體試驗方案見表2。

2.2.3 模型的建立及其顯著性檢驗 運用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到銀耳多糖得率（y）對提取溫度（x1）、提取時間（x2）和液料比（x3）的二次多項回歸模型為：y=28.46+3.80x1+0.19x2-1.85x3+0.53x1x2-2.96x1x3-2.00x2x3-4.54x12+216x22-3.35x32。運用Design Expert軟件對17個試驗點的響應值進行回歸分析，得到回歸分析表（表3），對多糖提取得率有交互影響的響應面分析立體曲面圖見圖4至圖6。模型的可靠性可從方差分析及相關系數(shù)來考察。當P值顯著。在所選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序，其順序為提取溫度>液料比>提取時間。

2.2.4 因素間的交互影響 由圖5可以看出，若液料比固定不變，提取溫度與提取時間的交互作用對銀耳多糖得率的影響顯著，多糖得率隨提取溫度及提取時間的增加而呈現(xiàn)由低到高再降低的趨勢，即多糖得率在合適的提取溫度及提取時間下具有極大值，該極大值存在于響應曲面的頂部，即響應面的最高點，也是等高線最小得橢圓的中心點。

由圖6可知，若提取時間固定不變，提取溫度與液料比的交互作用對多糖得率的影響顯著，多糖得率隨提取溫度及液料比的增加而呈現(xiàn)由低到高再降低的趨勢，即多糖得率在合適的提取溫度及液料比下具有極大值，該極大值存在于響應曲面的頂部，即響應面的最高點，也是等高線的最小得橢圓的中心點。

由圖7可知，若提取溫度固定不變，提取時間及液料比之交互作用對多糖得率的影響顯著，多糖得率隨提取時間及液料比的增加而呈現(xiàn)由低到高再降低的趨勢，即多糖得率在合適的提取時間及液料比下具有極大值，該極大值存在于響應曲面頂部，即響應面的最高點，也是等高線最小得橢圓中心點。

提取溫度與液料比對銀耳多糖提取得率的交互效應最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；提取溫度與提取時間對銀耳多糖提取得率的交互效應次之；提取時間與液料比對銀耳多糖提取率的交互效應不顯著，相應表現(xiàn)為曲線較為平滑。

2.2.5 優(yōu)化最佳組合條件 通過上述分析可知，合適的提取溫度、提取時間和液料比有利于銀耳多糖的提取，因此可以采用軟件優(yōu)化功能或者利用二次方程模型分別對參數(shù)Xi求導，聯(lián)解求導所得的方程，即可得到最佳試驗條件。本試驗采用軟件Optimization的Numerical優(yōu)化功能，在試驗因素取值范圍內選擇最低點為出發(fā)點，響應值選取最大值，可優(yōu)化得到亞臨界水萃取銀耳多糖的理論最佳條件，即最佳提取溫度 137.8 ℃，提取時間30 min，液料比 30.81 mL/g，在此條件下，銀耳多糖提取得率的理論預測值為34.26%。考慮到實際操作的便利性，將銀耳多糖的最佳提取條件修正為提取溫度138 ℃、提取時間30 min、液料比30 mL/g。

2.3 驗證試驗

為檢驗RSM優(yōu)化法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進行銀耳多糖亞臨界水提取試驗，實際測定銀耳多糖的提取得率為34.58%，與理論預測值34.26%誤差約0.9%左右，證明響應面法適用于對銀耳多糖亞臨界水提取工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化，具有較高的實用價值。

2.4 亞臨界水提取法與傳統(tǒng)熱水浸提法的比較

從表4可以看出，亞臨界水提取法在提取溫度138 ℃、提取時間30 min、液料比30 mL/g條件下，銀耳多糖提取得率為34.58%。利用傳統(tǒng)熱水浸提法[11]，在提取溫度為100 ℃、提取時間 6 h、液料比 60 mL/g條件下，銀耳多糖提取得率僅為18.77%。由此可知，亞臨界水提取法可明顯降低銀耳多糖的提取時間并提高銀耳多糖提取得率。

3 結論

采用亞臨界水提取技術提取銀耳多糖，通過單因素試驗對該方法影響多糖提取得率的主要因素提取溫度、提取時間、液料比進行了研究，并在此基礎上采用三因素三水平響應面分析法進行了試驗，獲得亞臨界水提取銀耳多糖的最佳工藝條件為提取溫度138 ℃、提取時間30 min、液料比30 mL/g，此時銀耳多糖提取得率為34.58%。亞臨界水萃取法與傳統(tǒng)熱水浸提法相比，銀耳多糖的提取得率提高了84.23%，結果證實亞臨界水提取法具有提取時間短、提取效率高等優(yōu)點，是一種有效的銀耳多糖提取技術。

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