白酒酒糟中抗氧化乳酸菌的篩選及培養基優化

鐘正丹　何義國　趙興秀

摘要：采用稀釋涂布法結合革蘭氏染色、紙層析法從四川瀘州老窖濃香型白酒酒糟中分離乳酸菌，通過測定抗脂質過氧化率、超氧陰離子清除率、DPPH自由基清除率系統評價篩選的12株乳酸菌的抗氧化能力，旨在篩選出高抗氧化活性的乳酸菌，為天然抗氧化劑的開發及乳酸菌在功能性食品中的應用提供理論依據，并對其中1株抗氧化活性較高的4#菌株進行培養基優化。結果表明：共得到12株乳酸菌，其中4#菌株在上述3種評價體系中均表現出較強的抗氧化能力。對菌株4#進行培養基優化，其結果為牛肉膏20 g/L、葡萄糖15 g/L、pH值6，裝液量為60 mL，且優化后4#菌株抗氧化能力提高了43.73百分點，這將為抗氧化菌株的進一步應用以及抗氧化產品的開發提供一定的理論依據。

關鍵詞：酒糟；乳酸菌；抗氧化；培養基優化

中圖分類號： TS261.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0533-04

乳酸菌廣泛存在于泡菜、食醋、白酒、乳制品等發酵食品中，可改善食品風味，為發酵食品提供豐富的營養成分，提高食品附加值。有大量研究表明，乳酸菌具有調節腸道菌群、降低膽固醇、抑菌、抗癌、抗衰老、抗氧化等多種生理功能[1]。消費者對食品安全和食品生理功能日益關注，而乳酸菌具有天然無毒、保健益生等特性[2]，是一種天然抗氧化劑，這使其抗氧化能力研究成為食品工業的重點與熱點[3]。

在食品科學領域，抗氧化乳酸菌可防止食品中油脂酸敗，清除自由基從而阻止自由基連鎖反應。研究表明，機體內自由基與機體衰老、癌癥、心血管等疾病[4-5]也密切相關，開發抗氧化產品對抗衰老、預防疾病有著重要意義。目前，已有研究者針對抗氧化乳酸菌的篩選、體內外試驗、作用機制[6-7]、有效成分等方面進行了相應研究。如張書文通過體外試驗篩選抗氧化乳酸菌進行抗氧化效果研究[8]；劉天祎等從泡菜汁、鵝腸等原料中篩得2株抗氧化活性較高的干酪乳桿菌[9]。但對于抗氧化乳酸的研究仍處于初級階段，應用范圍還有待擴展。目前，抗氧化乳酸菌主要用于酸奶、抗氧化劑等方面，而在保健食品、酒類及飲料、化妝品等行業仍須不斷地開發及創新。

本研究從四川瀘州老窖濃香型白酒酒糟中分離抗氧化乳酸菌，以抗脂質過氧化率、超氧陰離子清除率、DPPH自由基清除率評價菌株抗氧化能力，得到抗氧化能力較強的乳酸菌，并可適應白酒生產過程中復雜的環境，這將對于抗氧化酒品及其乙醇飲料開發創新有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型白酒酒糟由四川瀘州老窖股份有限公司提供。

吐溫-80、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂粉、正丁醇、焦性沒食子酸、三羥甲基氨基甲烷等均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）；硫代巴比妥酸（上海科豐化學試劑有限公司）。

1.2 試驗儀器

55i+Ds-5M-UI正置生物顯微鏡（日本SONY公司）；UV2400紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；UP400S手提式超聲波細胞粉碎機（寧波新生物科技有限公司）；FL-2可調式封閉電爐（北京市永光明醫療器械有限公司）。

1.3 培養基

MRS固體培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 mL，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳 0.25 g，瓊脂18.0 g，用蒸餾水補足至1 L，pH值6.5。

初始培養基：蛋白胨25 g/L，葡萄糖20 g/L，檸檬酸氫二鈉2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，乙酸鈉5 g/L，硫酸錳0.28 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，吐溫-80 1 mL/L，裝液量50 mL（250 mL三角瓶），pH值6.5。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌的分離純化 稱取5 g酒糟于50 mL離心管中，加入50 mL 0.8%生理鹽水（加有玻璃珠），渦旋振蕩，靜置10 min，取1 mL上清液加入100 mL MRS液體培養基中，37 ℃ 靜置培養24 h。取1 mL培養液進行10倍梯度稀釋至10-7濃度，取0.1 mL不同濃度稀釋液進行涂布，37 ℃靜置培養24 h，挑取乳白色、圓形、較小、表面光滑、邊緣整齊、中央隆起的菌落進行劃線分離純化，并觀察其菌落形態。挑取培養時間為12 h的單菌落進行革蘭氏染色，觀察其顯微鏡下個體形態。將純化后菌株接種于MRS斜面，于4 ℃冰箱保藏。

1.4.2 過氧化氫試驗 挑取1環已純化菌株于潔凈試管內，滴加3%過氧化氫溶液2 mL，觀察結果。于0.5 min內發生氣泡者為陽性，不發生氣泡者為陰性[10]。

1.4.3 乳酸菌定性試驗 采用紙層析法[11]。

1.4.4 抗氧化乳酸菌的篩選

1.4.4.1 樣品前處理 無菌體發酵液（CFE）：挑取1環純化菌株接種于MRS液體培養基中活化，以2%接種量接入MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h后，4 000 r/min離心 20 min，收集菌體沉淀，取上清液進行無菌體細胞發酵液抗氧化能力的測定。

菌體細胞提取物（IC）：使用磷酸緩沖液（pH值7.0）洗滌菌體沉淀2次后，用無菌水調整為2×109個/mL的菌懸液，然后進行冰浴超聲波破碎（功率400 W、工作時間5 s、間隔時間5 s、破碎時間30 min），破碎液于8 000 r/min離心20 min，取上清液進行菌體細胞提取物抗氧化能力的測定。

1.4.4.2 抗脂質過氧化率測定[12] 在試管中依次添加 0.5 mL PBS、1 mL亞油酸、1 mL FeSO4、0.54 mL樣品。37 ℃水浴1.5 h，再添加0.2 mL三氯乙酸、2 mL硫代巴比妥酸，沸水浴30 min后迅速冷卻，4 000 r/min離心20 min后過濾，收集上清液，測定D532 nm。以無菌水代替樣品反應為空白組。抗脂質清除率的計算公式如下：

抗脂質過氧化率=（1-D532 nm/D532 nm（空白））×100%。

1.4.4.3 超氧陰離子自由基清除率測定 采用鄰苯三酚法[13]。

1.4.4.4 DPPH自由基清除率的測定[14] 在試管中依次添加4 mL DPPH、2 mL樣品、1 mL 50%乙醇，在暗處反應 60 min，離心20 min，取上清液，測定D517 nm。其計算公式如下：

DPPH自由基清除率=（1-D517 nm/D517 nm（空白））×100%。

1.4.5 抗氧化乳酸菌的培養條件優化 挑取1環抗氧化較強的菌株9#，接種于初始培養基中，37 ℃靜置培養24 h備用。以DPPH自由基清除率為評價指標，分別研究不同碳源種類（葡萄糖、蔗糖、淀粉）、氮源種類（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏）、碳源添加量（15、20、25、30 g/L）、氮源添加量（20、25、30、35 g/L）、pH值（4.0、5.0、6.0、7.0）、裝液量（40、50、60、70 mL）對DPPH自由基清除率的影響，從而得到最優培養基組合。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從濃香型白酒酒糟中共分離出12株乳酸菌，分別編號為1～12#，通過觀察其菌落形態、個體形態，12株過氧化氫試驗結果均為陰性，故初步鑒定為乳酸菌。其菌落形態、個體形態以4#為例，如圖1所示。

2.2 乳酸菌定性試驗

將12株菌株分別接種至MRS液體培養基中，于37 ℃、 150 r/min 培養24 h，離心取上清液進行紙層析，計算各菌株Rf值，其結果見表1。由表1可知，乳酸的Rf值為0.53，各菌株Rf值均為0.53左右，故12株菌株可確定為乳酸菌。

2.3 抗氧化乳酸菌的篩選

2.3.1 抗脂質過氧化率測定 12株菌分別接種于MRS液體培養基中于，37 ℃ 150 r/min培養24 h，經樣品處理后得到無菌體發酵液和菌體細胞提取物，分別測定抗脂質過氧化清除率，其結果如表2所示。

由表2可知，不同乳酸菌的發酵液和菌體細胞提取物的抗脂質過氧化率差異很大。其中，發酵液的抗脂質過氧化清除率較高的有1#、2#、3#、4#、9#，分別為10.07%、13.09%、11.12%、10.23%、10.07%。菌體細胞提取物的抗脂質過氧化清除率較高的有1#、4#、9#、11#，分別為44.28%、47.71%、47.33%、41.60%。無菌體發酵液和菌體細胞提取物的抗脂質過氧化清除率均較高的為1#、4#、9#。

2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力的比較 12株菌分別接種于MRS液體培養基中，于37 ℃、150 r/min培養24 h，經樣品處理后，得到無菌體發酵液和菌體細胞提取物，通過鄰苯三酚法分別對各菌株的超氧陰離子自由基清除能力進行研究，結果如表3所示。

由表3可知，無菌體發酵液的超氧陰離子清除率較高的有2#、3#、4#、9#，分別為32.47%、35.12%、43.76%、35.01%。菌體細胞提取物的超氧陰離子清除率較高的有 4#、5#、9#，分別為37.56%、40.88%、42.29%。無菌體發酵液和菌體細胞提取物的超氧陰離子清除率均較高的為4#、9#。

2.3.3 DPPH自由基清除率的比較 12株菌分別接種于MRS液體培養基中，于37 ℃、150 r/min培養24 h，經樣品處理后，得到無菌體發酵液和菌體細胞提取物，分別對各菌株的 DPPH 自由基清除能力進行研究，結果如表4所示。

由表4可知，無菌體發酵液的DPPH自由基清除率較高的有4#、9#、10#，分別為23.96%、25.96%、19.76%；菌體細胞提取物的DPPH自由基清除率較高的有1#、2#、4#、5#、9#，分別為33.04%、38.41%、41.07%、35.28%、33.21%。無菌體發酵液和菌體細胞提取物的DPPH自由基清除率均較高的為4#、9#。

綜上所述，菌株4#、9#的抗氧化能力最強，且其菌體細胞提取物的抗氧化能力均高于無菌體發酵液，后續試驗選擇4#菌株作為出發菌進行研究。

2.4 抗氧化乳酸菌的培養基優化

2.4.1 不同碳源及碳源添加量對抗氧化能力的影響 選取抗氧化性較強的乳酸菌4#，分別接入不同碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉）和不同碳源添加量（15、20、25、30 g/L）MRS液體培養基中培養，測定無菌體發酵液對DPPH自由基清除率，結果如圖2和圖3所示。

由圖2和圖3可知，以葡萄糖為碳源時，無菌體發酵液對DPPH自由基清除率最高，達到21.36%；葡萄糖添加量為15 g/L，清除率達到最高，為47.5%，并隨著添加量的增加，清除率緩慢下降后在20～25 g/L時急劇下降。故菌株4#最佳

碳源為葡萄糖，最佳添加量為15 g/L。

2.4.2 不同氮源及氮源添加量對抗氧化能力的影響 將乳酸菌4#分別接入不同氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏）和不同氮源添加量（20、25、30、35 g/L）MRS液體培養基中培養，測定無菌體發酵液對DPPH自由基清除率，其結果如圖4、圖5所示。

由圖4、圖5可知，氮源為牛肉膏時，其無菌體發酵液對DPPH自由基清除率明顯高于酵母膏和蛋白胨；同時，清除率隨著牛肉膏添加量的增加而先增高后緩慢降低，在25 g/L時，DPPH自由基清除率最高，達到30.86%，故菌株4#最佳氮源為牛肉膏，最佳添加量為25 g/L。

2.4.3 不同pH值和裝液量對抗氧化的影響 pH值和裝液量是影響菌體生長的重要指標，將乳酸菌4#分別接入不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0）和不同裝液量（40、50、60、70 mL）MRS液體培養基中培養，測定無菌體發酵液對DPPH自由基清除率，結果見圖6、圖7。

由圖6、圖7可知，隨著pH值上升，DPPH自由基清除率明顯上升后下降；pH值為6時，清除率達到最高，為4758%，因此培養基的最優pH值為6。不同裝液量的DPPH自由基清除率差異明顯，隨裝液量的增加，DPPH自由基清除率先上升后下降，在裝液量為60 mL時，DPPH自由基清除率最高為 42.57%，故菌株最佳裝液量為250 mL三角瓶中60 mL。

綜上所述，菌株4#的最佳培養基條件為：牛肉膏20 g/L、葡萄糖15 g/L、檸檬酸氫二鈉2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸錳0.25 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、吐溫-80 1 mL/L，pH值為7，裝液量為60 mL。

2.5 培養基優化驗證試驗

將菌株4#分別接入初始培養基和最佳培養基中，測定無菌體發酵液的抗脂質過氧化清除率、超氧陰離子清除率、DPPH 自由基清除率，比較培養基優化效果，其結果如表5所示。

由表5可知，優化后的無菌體發酵液的抗脂質過氧化率、超氧陰離子清除率稍有增高，DPPH自由基清除率明顯增高，分別增加6.18、8.13、29.42百分點。結合3種清除率，優化后菌種的抗氧化能力有較大的增長，增量達到43.73百分點。

3 結論

以四川瀘州老窖濃香型白酒酒糟為原料，采用稀釋涂布法結合革蘭氏染色、紙層析法分離乳酸菌，測定抗脂質過氧化率、超氧陰離子清除率、DPPH自由基清除率，以比較菌株抗氧化能力，并采用單因素試驗進行培養基優化。結果表明：共得到12株乳酸菌，以抗脂質過氧化率、超氧陰離子清除率、清除DPPH自由基為抗氧化評價指標，菌株4#、9#抗氧化能力最強。采用單因素試驗對4#培養基的碳源、碳源添加量、氮源、氮源添加量、pH值、裝液量進行優化，其優化結果為牛肉膏20 g/L、葡萄糖15 g/L、pH值7，裝液量為60 mL，且優化后4#抗氧化能力提高了43.73百分點，這為抗氧化菌株的生產應用、開發相關抗氧化產品提供一定的理論依據。同時，對于該菌株的培養條件優化以及工業應用還有待進一步探索。

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