不同氮磷濃度對蛋白核小球藻砷富集和轉化的影響

劉　聰，許平平，王　亞，鄭燕恒，林巧云，唐　皓，張春華，葛　瀅*

（1.南京農業大學資源與環境科學學院，江蘇省海洋生物學重點實驗室，南京 210095；2.南京農業大學生命科學實驗中心，元素與生命科學示范實驗室，南京 210095）

不同氮磷濃度對蛋白核小球藻砷富集和轉化的影響

劉聰1，許平平1，王亞1，鄭燕恒1，林巧云1，唐皓1，張春華2，葛瀅1*

（1.南京農業大學資源與環境科學學院，江蘇省海洋生物學重點實驗室，南京 210095；2.南京農業大學生命科學實驗中心，元素與生命科學示范實驗室，南京 210095）

氮（N）、磷（P）是影響蛋白核小球藻生長的重要因素，通過改變培養液中N、P的濃度，可能實現對蛋白核小球藻富集砷（As）進行調控。為探討N、P濃度對這種微藻吸收As的影響是否與其生長變化有關，采用室內培養實驗，首先研究不同N、P濃度對蛋白核小球藻生長的影響；進而選擇不影響小球藻生長的N（247、24.7 mg·L-1）、P（6、0.6 mg·L-1）濃度組合，設置0.8、8 mg·L-1的亞砷酸鹽（As3+）和砷酸鹽（As5+）處理3 d，研究N、P濃度對小球藻As富集和轉化的影響。結果表明，當P濃度為6 mg·L-1時，N濃度降低到24.7 mg·L-1不會影響小球藻對As3+和As5+的富集及其胞內As形態的轉化；而當N濃度為247 mg·L-1時，P濃度降低到0.6 mg·L-1則會顯著增加小球藻對As3+和As5+的吸收和富集，藻細胞內As5+還原、甲基化和外排也顯著增強。因此，在不影響小球藻細胞生長的條件下，P對其As富集和轉化過程的影響比N更為顯著。

蛋白核小球藻；氮；磷；砷；富集；轉化

劉聰，許平平，王亞，等.不同氮磷濃度對蛋白核小球藻砷富集和轉化的影響［J］.農業環境科學學報，2016，35（9）：1665-1671.

LIU Cong，XU Ping-ping，WANG Ya，et al.Effects of various nitrogen and phosphorus concentrations on arsenic accumulation and transformation in Chlorella pyrenoidesa［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（9）：1665-1671.

砷是自然界中有毒的的類金屬元素，被列為Ⅰ類致癌物［1］。隨著經濟和社會的發展，工農業活動的不合理排放導致砷污染日趨嚴重，引起了國內外學者的廣泛關注。在自然水體中，砷含量范圍為0.5～5000 μg· L-1［2］，在某些受污染的水體中甚至高達20 mg·L-1［3］，其形態以砷酸鹽（As5+）和亞砷酸鹽（As3+）為主［4］。

微藻是海洋和淡水生態系統中的初級生產者，以陽光、CO2、無機鹽和水分自養生長，通過光合作用產生氧氣和有機物，對維護水環境生態平衡具有重要作用。小球藻分布廣泛、適應能力強，對砷的富集高達50 000 μg·g-1［5］，因而在含砷廢水的凈化上有巨大的潛力［6］，但其修復效果受到培養介質中營養條件的影響［7］。

氮（N）、磷（P）等無機營養鹽是限制小球藻生長和繁殖的重要因子，不足或過多都會對藻細胞的生長和砷代謝過程產生影響。磷酸鹽（PO3-4）能與As5+競爭藻細胞膜上的磷酸鹽結合位點［8-9］，因此P含量的變化會影響小球藻對As的吸收和毒性。Bahar等［6］發現低 P增加了As5+對小球藻的毒性，Knauer等［10］報道低P促進了蛋白核小球藻對As5+的富集，Levy等［11］和Karadjova等［12］則證實增加P營養降低了As5+和As3+對小球藻的吸收和毒性效應。

與P相比，N對微藻As富集和轉化的影響則報道很少。Maeda等［13］發現隨著培養液硝酸鹽（）濃度的增加，念珠藻細胞中總砷的含量減少，Wang等［14］發現缺N條件下萊茵衣藻能夠富集更多的As3+。然而在上述研究中，N濃度的變化對藻類的生長有顯著的影響［13-14］，由此可能造成微藻As富集的差異。為了排除N、P濃度變化對小球藻生長的影響，本文在多個N、P水平中選出不影響藻細胞生長的N、P組合，再結合As3+和As5+處理，研究N、P濃度對小球藻As富集和轉化的影響，為揭示蛋白核小球藻As代謝的調控機制、提高水環境砷污染的修復效率提供理論依據。

1　材料與方法

1.1藻種及培養條件

蛋白核小球藻（C.pyrenoidesa）FACHB-5購于中科院武漢水生生物研究所國家淡水藻種庫。所用培養基為BG-11［15］，pH調至7.1，高壓蒸汽滅菌（121℃、30 min），培養條件為：溫度30±1℃，光照明暗比12 h∶12 h，光照強度為3500～4000 lx，培養期間每天定時搖勻3次。

1.2N、P濃度對蛋白核小球藻生長的影響

培養基N源和P源分別為NaNO3（247 mg N·L-1）和K2HPO4（6 mg P·L-1）。為研究N、P濃度對小球藻生長的影響，在固定一種元素濃度后，設置另一種元素的系列濃度（表1），連續培養，每天用酶標儀測定小球藻的OD680值。固定P元素、不同N濃度的藻樣于第3 d收集，固定N元素、不同P濃度藻體由于第3 d生長無差異，故延長至第5 d收集，用甲醇提取色素，利用分光光度法分別測定其在470、653、666 nm處的A值，計算其葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素的含量［16］。

表1　培養液的N、P濃度設置Table 1 N and P concentrations in culture solution

1.3N、P濃度對蛋白核小球藻砷富集和轉化的影響

小球藻培養至對數期后，離心得到的藻細胞用去離子水清洗2次，將其轉入不同N、P濃度的BG11培養基。由于小球藻對缺N很敏感，為了避免藻細胞生長受抑制對As富集和代謝的影響，培養液N濃度設置為247 mg·L-1和24.7 mg·L-1，且沒有進行缺N處理；另一方面，小球藻在生長過程中能大量吸收P并儲存在細胞內，為了降低藻細胞的P含量，小球藻在缺P營養液中培養2 d后，再轉至P濃度為6 mg·L-1和0.6 mg·L-1的培養基中。與前述小球藻生長實驗類似，N、P濃度設置也采取了固定一種元素濃度、變換另一種元素濃度的方法，即247 mg·L-1N與6、0.6 mg· L-1P組合、6 mg·L-1P與247、24.7 mg·L-1N組合，在此基礎上設置As3+和As5+處理濃度0.8 mg·L-1、8 mg· L-1，每個處理3個平行，并以不加砷的藻液作為對照，初始OD680為0.085。為消除pH變化的影響，培養液中加入20 mmol·L-13-嗎啉丙磺酸（MOPS），控制pH 在7.1左右。培養3 d后，離心7 mL藻液，用去離子水清洗藻體2次，樣品消解后測定其富集的砷含量。另外離心7 mL藻體，用pH 7.0的0.1 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗（每次用量為5 mL并沖洗3次），去除藻細胞表面吸附的砷［17］，測定藻內吸收的砷含量及其形態。

1.4藻體總砷的測定

稱取干重為1.00 g樣品，加入2 mL體積比為4∶1 的HNO3∶HClO4混合酸，轉至玻璃消煮管中，靜置過夜，采用海能SH230石墨消解儀（上海海能實驗儀器科技有限公司）電熱消解至溶液澄清透明，趕酸至剩余約0.2 mL液體，用去離子水潤洗并移至5 mL容量瓶中，加濃鹽酸（優級純）、10%硫脲和10%抗壞血酸混合溶液后定容［18］。采用氫化物發生-雙道原子熒光光度計（HG-AFS，北京吉天儀器有限公司）測定樣品砷含量，同批次運用同樣方法消解標準物質（NIST-1568b），回收率為84%～102%，表明測定方法可靠。

1.5砷形態提取及測定

稱取干重樣品1.00 g，加入0.28 mol·L-1HNO3進行提取，90℃水浴超聲10 min后14 000×g離心10 min，重復提取3次［19］，上清液合并后用0.22 μm濾膜過濾，濾液采用高效液相-氫化物發生-原子熒光（HPLC-HG-AFS，北京吉天儀器有限公司）測定小球藻中砷的形態。檢測條件如下：進樣體積100 μL，陰離子交換柱（Hamilton PRP-X100），流動相為17.5 mmol·L-1磷酸氫二銨（pH=6.1），等度洗脫；載流5%鹽酸；還原劑1.5%硼氫化鉀＋0.5%氫氧化鉀；屏蔽氣700 mL·min-1；載氣Ar，600mL·min-1；光電倍增管電壓270 V；燈電流100 mA。本實驗中砷提取效率為84.7%～ 108.5%，說明提取方法可靠。

1.6數據處理

運用Excel 2007和SPSS 20統計分析軟件進行數據處理與分析，用SigmaPlot 12.5作圖。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan檢驗進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2　結果與分析

2.1不同N、P濃度對蛋白核小球藻生長的影響

由表2可以看出，P濃度為6 mg·L-1時，N濃度過高或過低都會影響小球藻的生長。而在藻體培養3 d內，24.7 mg·L-1和247 mg·L-1的N濃度對OD680值、葉綠素a、b及類胡蘿卜素含量都沒有顯著影響。這表明，3 d內24.7 mg·L-1和247 mg·L-1的N濃度對小球藻的生長沒有影響。

當N濃度為247 mg·L-1，P濃度過高或過低也會影響小球藻的生長。藻體培養3 d時各個P濃度都不影響小球藻的OD680值，因此延長至第5 d，發現P濃度為0.6 mg·L-1和6 mg·L-1，對小球藻的OD680、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素都沒有顯著性差異（表3）。這表明，5 d內0.6 mg·L-1和6 mg·L-1的P濃度對小球藻生長沒有影響。

表2　不同N濃度對蛋白核小球藻生長的影響（3 d）Table 2 Effects of different N concentrations on growth of C.pyrenoidesa（3 d）

表3　不同P濃度對蛋白核小球藻生長的影響（5 d）Table 3 Effects of different P concentrations on growth of C.pyrenoidesa（5 d）

2.2不同N、P濃度對蛋白核小球藻砷富集的影響

由表4和表5可知：相同N、P濃度處理下，小球藻對砷的富集和吸收總量隨As3+和As5+處理濃度的增加而增加。當N為247 mg·L-1時，降低P濃度導致藻細胞對As3+和As5+的富集和吸收都顯著增加（P＜0.05），而當P濃度為6 mg·L-1時，降低N濃度卻不影響小球藻對As3+和As5+的富集和吸收。

2.3As3+處理下不同N、P濃度對蛋白核小球藻胞內砷形態的影響

As3+處理小球藻3 d后，不同P濃度對藻細胞As形態及各形態的含量有顯著影響（圖1a）。在P-As3+處理組合下，胞內主要以As3+和As5+兩種形態存在，其中As5+所占比例為42.8%～57.1%。當As3+濃度為8 mg·L-1時，胞內都出現了二甲基砷（DMA），表明當外界As濃度高時，小球藻體內存在砷甲基化途徑。此外，當P濃度降為0.6 mg·L-1時，相同濃度的As3+處理下，胞內As3+、As5+和DMA的含量都有明顯的增加。

然而，當培養液P濃度不變，N濃度降為24.7 mg·L-1時，相同濃度的As3+處理下，N濃度的降低不會影響小球藻胞內各As形態的含量（圖1b）。在N-As3+處理組合下，當0.8 mg·L-1的As3+處理時，胞內存在As3+和As5+兩種形態無機As，As5+所占比例為67.7%～68.9%。當8 mg·L-1的As3+處理時，胞內As以As3+、As5+和DMA三種形態存在，所占比例分別為35.8%～37.1%，48.3%～52.0%和12.2%～14.6%。

2.4As5+處理下不同N、P濃度對蛋白核小球藻胞內砷形態的影響

由圖2可知，小球藻在As5+處理3 d后，各個N、P濃度組合下胞內絕大多數是As5+，約占總As含量的94.2%～99.4%。不同濃度P-As5+處理組合下小球藻胞內砷形態有明顯的差異，當N濃度固定為247 mg·L-1、P降為0.6 mg·L-1時，會促進胞內As5+還原成As3+，隨后甲基化產生二甲基砷（DMA），并且在培養液中檢測到3.23 μg·L-1的DMA，說明小球藻在體內甲基化后會將DMA排出體外。與As3+處理類似，當P濃度固定為6 mg·L-1、N濃度降為24.7 mg·L-1時，胞內各As形態的含量沒有明顯的變化，當As5+處理濃度從0.8 mg·L-1上升至8 mg·L-1時，胞內的As形態從只有As5+變為以As5+為主，并有少量As3+。

表4　As3+處理下不同N、P濃度對小球藻富集砷和吸收砷的影響Table 4 Effects of different N and P concentrations on As accumulation and uptake of C.pyrenoidesa exposed to As3+

表5　As5+處理下不同N、P濃度對小球藻富集砷和吸收砷的影響Table 5 Effects of different N and P concentrations on As accumulation and uptake of C.pyrenoidesa exposed to As5+

圖1不同濃度P-As3+（a）和N-As3+（b）處理組合下蛋白核小球藻胞內各種形態砷的含量Figure 1 Content of various As species in C.pyrenoidesa under different concentrations of P-As3+（a）and N-As3+（b）combinations

圖2不同濃度P-As5+（a）和N-As5+（b）處理組合下蛋白核小球藻胞內各種形態砷的含量Figure 2 Content of various As species in C.pyrenoidesa under different P-As5+and N-As5+concentration combinations

3　　討論

3.1 N、P營養對蛋白核小球藻生長的影響

蛋白核小球藻含有豐富的蛋白質，對N營養的需求比對P營養的需求更敏感。當提供較少的N時，N營養不能維持小球藻的正常生長，由于硝酸鹽還原酶的活性存在一定閾值，提供較多的N元素時也會抑制其生長［20］。培養3 d時發現24.7 mg·L-1和247 mg·L-1的N濃度處理下小球藻生長和色素含量達到最佳。當提供較多或較少的P元素時，前3 d小球藻的生長并沒有明顯的變化，這是由于小球藻細胞具有儲存磷酸鹽的功能，外界P含量較低時會利用體內的磷酸鹽來維持其生長的需要［21］，但隨著體內P含量的消耗，當培養液中P濃度過高或過低時都表現出顯著抑制其生長。培養5 d和P濃度在0.6 mg·L-1和6 mg·L-1時，生長和色素含量達到最大。這說明N、P營養過高或者過低都會顯著影響蛋白核小球藻的生長和色素的合成，與馬彩虹等［22］發現N、P濃度過高和過低都會降低小球藻的生長是一致的。此外，微藻的生長也與其N∶P關系密切相關［23］，因此在大規模培養蛋白核小球藻時，N、P濃度和N∶P是生長的重要影響因素，適宜的N、P濃度和N∶P才能促進小球藻的快速生長。

3.2N、P營養對蛋白核小球藻砷富集的影響

有研究指出，N濃度會影響微藻對As的富集。Maeda等［13］用100 mg·L-1的As5+處理念珠藻，細胞中總砷的含量隨培養液中硝酸鹽（）濃度的增加而減少。Wang等［14］發現缺N條件下萊茵衣藻能夠富集更多的As3+。然而本研究結果表明，降低N濃度為24.7 mg·L-1沒有改變蛋白核小球藻對As3+和As5+的富集量。造成這些差異的原因在于不同N濃度下微藻的生長是否受影響。上述試驗中，在不同的N濃度下，念珠藻和萊茵衣藻的生長差異顯著。本實驗選擇不影響小球藻生長的兩個N濃度，能較為準確地反映N對小球藻As富集的影響。

Levy等［11］和Karadjova等［12］指出，P濃度的降低會增加小球藻對砷的富集。本試驗與前人的結果是一致的。降低P濃度為0.6 mg·L-1會顯著增加蛋白核小球藻對As3+和As5+的富集量。低P會促進小球藻對As5+的吸收是由于As5+和P的競爭作用，而低P會促進小球藻對As3+的吸收可能是由于培養液中P濃度降低時，會促進小球藻合成更多數量的轉運體或者更強能力的轉運體來吸收更多的As3+［12］。由此可見，胞外P濃度對微藻As3+和As5+富集有著重要的影響。這對提高水環境砷污染的修復效率提供了理論依據。

3.3N、P營養對蛋白核小球藻砷轉化的影響

在As3+處理后，小球藻胞內As3+和As5+的比例介于30.6%～37.1%和42.8%～69.4%，As3+處理濃度提高到8 mg·L-1時，藻細胞內出現了DMA（圖1）。其他微藻也有類似的結果，例如，集胞藻在As3+處理時能啟動氧化機制，將大部分的As3+轉化為毒性較小的As5+后存儲［24］。當As3+處理濃度更高，小球藻則通過甲基化機制，將體內過量的無機砷轉化為毒性更小的DMA。

As5+處理時，小球藻胞內94.2%～99.4%都是As5+，As3+只占總As的0.63%～4.19%，說明小球藻的As還原很少（圖2）。同樣，Levy等［11］和Murray等［25］的結果發現淡水藻體內As5+還原成As3+的比例為1%～6%。As5+還原量低可能是與小球藻胞內高達8 g·kg-1的P含量有關，P能與砷酸鹽還原酶結合，不利于胞內As5+的還原。

P濃度為6 mg·L-1，且N濃度降為24.7 mg·L-1時，無論As3+和As5+處理，都沒有改變小球藻體內砷形態轉化。這說明在不影響小球藻生長的前提下，一定程度上N濃度的變化對小球藻砷代謝沒有影響。有研究表明缺N條件下會促進念珠藻甲基化，生成MMA和DMA［13］，可能是由于缺N時，念珠藻會合成刺激砷富集和甲基化的固氮酶［26］。本實驗中小球藻是否也存在同樣的固氮酶仍需進一步研究。

N濃度為247 mg·L-1且P降為0.6 mg·L-1時，促進小球藻體內的As5+還原為As3+，并產生DMA。這與不同P水平下鈍頂螺旋藻As代謝的結果［27］是一致的。培養液中檢測到了DMA，說明胞內As的外排也得到了強化。

4　結論

（1）固定N為247 mg·L-1和P為0.6、6 mg·L-1，以及固定P為6 mg·L-1和N為24.7、247 mg·L-1的濃度組合對蛋白核小球藻的生長沒有影響。

（2）上述N、P濃度組合中，降低N濃度不會影響小球藻對As3+和As5+的富集，而降低P濃度則會顯著增加兩種形態As的富集。

（3）As3+和As5+處理時，小球藻胞內存在As氧化、還原和甲基化過程。降低N濃度不影響As在胞內的形態轉化，而降低P濃度會促進As的還原、甲基化和外排。

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Effects of various nitrogen and phosphorus concentrations on arsenic accumulation and transformation in Chlorella pyrenoidesa

LIU Cong1，XU Ping-ping1，WANG Ya1，ZHENG Yan-heng1，LIN Qiao-yun1，TANG Hao1，ZHANG Chun-hua2，GE Ying1*
（1.College of Resource and Environmental Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.Laboratory Centre of Life Science，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Nitrogen（N）and phosphorus（P）are important factors controlling the growth of microalgae such as Chlorella pyrenoidesa.The accumulation of arsenic（As）by this alga may be regulated through adjusting N and P concentrations in the culture.However，it is unclear whether the effects of N and P on the As uptake are related to microalgal growth changes.Therefore，we first studied the impacts of N and P concentrations on the growth of C.pyrenoidesa，and then chosen N（247 mg·L-1，24.7 mg·L-1）and P（6 mg·L-1，0.6 mg·L-1）concentrations that had no effects on the algal growth，to investigate their effects on the As metabolism in this algae under exposure of 0.8 mg·L-1and 8 mg·L-1As3+and As5+.Results showed that the algal As accumulation and transformation were not affected when P was 6 mg·L-1and N was decreased from 247 mg·L-1to 24.7 mg·L-1.However，these processes were significantly impacted when N was 247 mg·L-1and P was decreased from 6 mg·L-1to 0.6 mg·L-1.The decrease in P supply also promoted the reduction，methylation and excretion of As in C. pyrenoidesa.These results indicate that，when N and P have no effects on the algal growth，P influences the As accumulation and transformation greater than N does.This study would provide a theoretical basis for elucidating the regulatory mechanisms of As metabolism and enhancing the efficiency of As pollution remediation in water.

Chlorella pyrenoidesa；nitrogen；phosphorus；arsenic；accumulation；transformation

X52

A

1672-2043（2016）09-1665-07doi：10.11654/jaes.2016-0402

2016－03－26

國家自然科學基金項目（41371468，31400450）

劉聰（1992—），女，河北邢臺人，碩士研究生，主要研究方向為環境污染控制及生物修復。E-mail：2013103006@njau.edu.cn

葛瀅E-mail：yingge711@njau.edu.cn