防治煙草黑脛病內生細菌的分離鑒定及促生作用研究

岳耀穩 王麗萍 張仲友

摘要 通過常規分離方法、平板對峙培養法從健康煙株的根、莖、葉中分離得到內生細菌127株，從中篩選出8株菌株對煙草黑脛病菌有明顯抗性，并對其進行了皿內拮抗試驗、發酵液抑菌試驗、溫室盆栽試驗和發酵液浸種、灌根試驗，結果表明：8個菌株培養液濾液中存在具有明顯抑菌作用的活性成分。以菌株wy11對煙草黑脛病的防效最好，防效為51.7%。菌株wy2發酵液浸種對煙草幼苗有顯著促生作用，能顯著提高地上部分鮮重、莖圍、根長、葉長、葉寬。

關鍵詞 煙草黑脛病病原菌；內生細菌；分離鑒定；促生作用

中圖分類號 S435.72 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）09-0120-03

煙草黑脛病是土傳真菌病害，在我國各產煙省均有不同程度的發生[1]。篩選有益的內生細菌有可能成為生物防治中有潛力的微生物農藥、增產菌等加以利用[2]。因此，通過對皖南各煙區大量采樣，分離出多種內生細菌，篩選出有效的黑脛病拮抗菌株，并對其促生作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 供試煙草品種及菌株

內生細菌為云煙87、云煙97、云煙99、K326共4個品種的煙草植株成熟期的根、莖及不同生長期的葉片等組織進行采樣并分離獲得。菌株為煙草黑脛病（病原）菌162。

1.2 主要試劑及培養基

內生細菌DNA提取、16S rDNA片段擴增、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為寶生物工程（大連）產品；其余試劑均為國產分析純。內生細菌分離和培養用改良的NA（牛肉浸膏1.0 g，酵母浸出汁3.0 g，瓊脂17.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0）、液體培養用LB，煙草黑脛病菌的培養用CA[3]。

1.3 煙草內生細菌的分離、純化、保存、編號規則

采集4個品種煙草不同生長期長勢良好無病煙株的葉及成熟期的根和莖，對分離菌株進行統一編號。如cg3，數字前2個小寫英文字母分別代表分離時期、煙草器官的縮寫（表1），數字代表分離序號。

2 結果與分析

2.1 煙草內生細菌的分離與平板抑制作用

對內生細菌的分離結果發現，培養基上長出大量菌落，菌落形態存在明顯差異，說明煙草組織中不僅存在大量的內生細菌，且內生細菌的種類豐富（圖1）。從4個品種煙草一共分離純化出127株內生細菌，并從中篩選出了26個菌株對煙草疫霉菌有平板拮抗作用（表2），12個菌株對煙草黑脛病菌有較強拮抗作用（表3），其抑菌帶清晰透明，寬度均達到5 mm以上（圖2）。

從表3、圖3可以看出，對煙草黑脛病菌抑菌活性與空白對照相比，除了cg16、cj22、wy3、wy5無顯著差異外，其余8個菌株的抑菌活性均達顯著水平。

2.2 拮抗內生細菌對煙草黑脛病的盆栽防效

參試菌株共8個煙草內生細菌，分別為cg24、cj27、cj17、cj20、wy2、wy11、wy4、wy16。從表4可以看出，在接種病菌后第14天，各處理均不同程度地發病。除菌株cj27外，其他7株均顯示出一定的防病效果，為6.5%～51.7%。其中以wy11表現突出，病情指數為33.3，防效為51.7%。由此說明，生防菌wy11對黑脛病的防效最佳。

2.3 拮抗細菌的促生作用測定

2.3.1 拮抗內生細菌對種子萌發及根長的影響。選擇對煙草黑脛病菌有較強拮抗活性的8個分離菌株為測試菌株，發現8株細菌菌液處理的煙草種子都能正常發芽和生長，表明8株細菌不是煙草的致病菌。表5顯示各菌液處理組發芽率與對照無差異，說明8個菌株菌液處理對種子萌發沒有顯著影響。14 d后測量根系長度，結果表明，大部分菌株對根的生長有促進作用，根長都高于對照。菌液處理組煙苗根長分別增長0.9%～30.3%（表5）。尤以wy2最為明顯，總根長達30.1 cm。利用DPS軟件進行統計分析，在α=0.05水平上，wy2的促進作用最顯著。根長比LB對照增加30.3%，與清水（CK）和LB對照相比，差異達到顯著水平（圖4）。由此可見，wy2浸種處理后，對煙草有明顯的促生作用，表現為顯著的促進根伸長，具有進一步開發的意義[4-6]。

2.3.2 拮抗細菌培養液灌根對煙草苗期生長的影響。經內生細菌10倍wy2發酵液浸種處理后，相比10倍LB和清水對照，煙草幼苗地上部分鮮重、根長、莖圍、最大葉長、葉寬均有一定程度的增加。從表6可以看出，地上部分鮮重、根長、莖圍與對照間差異性達到顯著水平。表明內生細菌wy2發酵液對煙草幼苗有明顯的促生作用，有利于植株后期的健康生長（圖5、6）。

3 結論與討論

試驗結果表明，除菌株cj27外，其他7株內生細菌處理均顯示出一定的防病效果，其中以wy11表現突出。大部分拮抗內生細菌菌液對根的生長有促進作用，尤以wy2最為明顯，其發酵液對煙草幼苗有明顯的促生作用。通過篩選，獲得了1株有一定防病效果的內生細菌wy11，對煙草黑脛病的生物防治研究具有一定的指導意義[7-8]。因此，wy11和wy2菌株在煙草防病促生方面具有潛在的應用價值，但其實用發酵條件、防病促生機理、大田應用效果等還需進一步研究。

4 參考文獻

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