熊果酸對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的研究

江　華　張奕穎　尹素改　張小莉　馮　黎　劉勝利　張秋萍.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450046；.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院ICU，河南鄭州450000；.武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫系，湖北武漢4007

熊果酸對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的研究

江華1張奕穎2尹素改1張小莉1馮黎1劉勝利1張秋萍3
1.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450046；2.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院ICU，河南鄭州450000；3.武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫系，湖北武漢430071

目的探討熊果酸（UA）誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29凋亡的作用機(jī)制。方法MTT法觀察UA對HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用；熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)觀察HT-29細(xì)胞的凋亡情況；Western blot檢測細(xì)胞色素c（cyt-c）、caspase-3及Livin蛋白的表達(dá)。結(jié)果UA對HT-29細(xì)胞具有明顯的的增殖抑制作用，并呈一定的濃度和時(shí)間依賴性；熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，50 μmol/L的UA作用24 h后，較多細(xì)胞呈現(xiàn)出凋亡的特征性改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，UA可將HT-29細(xì)胞阻滯于G1期，隨著UA濃度的增高，細(xì)胞凋亡率也相應(yīng)增加；Western blot結(jié)果顯示，UA作用24 h后，Livin蛋白和caspase-3酶原的表達(dá)逐漸降低，線粒體釋放的cyt-c逐漸增多，活化的caspase-3片段逐漸增加。結(jié)論UA對HT-29細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，其機(jī)制可能與UA阻滯HT-29細(xì)胞的細(xì)胞周期、激活線粒體凋亡途徑以及下調(diào)凋亡抑制蛋白Livin的表達(dá)有關(guān)。

熊果酸；人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29；凋亡

［Abstract］Objective To investigate the apoptosis-inducing mechanism of ursolic aicd（UA）in human colon cancer cell HT-29.Methods The inhibitory effect of UA on the growth of HT-29 cells was evaluated by MTT assay.Apoptosis was determined by fluorescence microscopy and flow cytometry.The expressions of apoptosis-associated proteins including cytochrome c（cyt-c），caspase-3 and Livin were assessed by Western blot analysis.Results UA inhibited HT-29 cell proliferation in a time-and dose-dependent manner.Fluorescent microscope indicated characteristics of apoptosis present in cells after UA-treated（50 μmol/L，24 h）.Flow cytometry showed that UA inhibited HT-29 in G1phase，and the apoptosis rate of HT-29 cell exposured to UA increased，corresponding to the concentration of UA.The inceasing of the release of cyt-c from the mitochondria and the activated fragment of caspase-3 were detected by Western blot，while the expression of procaspase-3 and Livin was decreased gradually.Conclusion UA can inhibit the proliferation of HT-29 cells effectively in vitro.The mechanism of above-mentioned phenomena may be related with the arrest effect of UA in the cell cycle of HT-29，activated mitochondrial apoptotic pathway，and down-regulating the expression of Livin.

［Key words］Ursolic acid；Human colon cancer cell HT-29；Apoptosis

熊果酸（Ursolic acid，UA），又叫烏蘇酸、烏索酸，它在自然界中存在廣泛，是熊果、白花蛇舌草、烏梅等多種植物的主要活性成分，具有多種生物學(xué)活性，包括護(hù)肝［1］、抗炎［2-3］、抗血管生成［4］、降血糖［5］以及抗腫瘤［6-8］等作用。現(xiàn)在人們?nèi)找嬷匾昒A的抗腫瘤作用，它可以抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、減少腫瘤血管的生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡等，但UA通過何種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)研究了UA對HT-29細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29購自北京大學(xué)；UA、胰酶、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、DMSO、Hoechst33258和碘化丙啶（PI）染料均購自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HYCLONE公司；新生小牛血清購自杭州四季青有限公司；鼠抗人cyt-c單克隆抗體和鼠抗人caspase-3單克隆抗體均購自Neomarkers公司；鼠抗人Livin單克隆抗體購自Stratagene Corporation公司；Western blot試劑盒購自Kirkegaard Perry Laboratories公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國NUAIRE公司產(chǎn)品；熒光酶標(biāo)儀為TECAN公司產(chǎn)品，型號：GENiOS VA200；流式細(xì)胞儀為BECKMAN產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)用含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HT-29細(xì)胞，每2～3天傳代1次，用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測UA對HT-29細(xì)胞的增殖抑制情況將HT-29細(xì)胞調(diào)節(jié)濃度至5×104個(gè)/mL，加入96孔培養(yǎng)板中，待其貼壁后加入U(xiǎn)A，使終濃度分別為10、20、30、40、50 μmol/L，并設(shè)立不含UA（0 μmol/L）的對照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各組中DMSO的最終含量均為0.5%（V/V）。將96孔板放在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48 h后加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 100 μL，震蕩混勻后用酶標(biāo)儀在570 nm波長下檢測各孔的吸光值（OD值）。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=［（對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對照組OD值］×100%。

1.2.3熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況將HT-29細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，接種濃度為1.25×105個(gè)/mL，加入U(xiǎn)A至終濃度為50 μmol/L，同時(shí)設(shè)立不含UA（0 μmol/L）的對照組。UA作用24 h后，0.25﹪胰酶消化，2000 r/min離心10 min收獲細(xì)胞，PBS洗滌，加入Hoechst 33258染液避光孵育10 min。離心棄上清，加入PI染液4℃孵育30 min，離心，PBS洗滌，滴片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率分別以0、20、30、40、50 μmol/L的UA作用于HT-29細(xì)胞24 h，胰酶消化，離心棄上清，冷PBS洗2次，用預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜。離心棄固定液，冷PBS洗2次，棄上清，加入RNA酶（1 mg/mL）240 μL，37℃水浴箱中放置30 min，加入PI染液避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)將HT-29細(xì)胞以5×106個(gè)/mL濃度培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，加入U(xiǎn)A使其終濃度分別為0、20、30、40、50 μmol/L作用24 h后，2000 r/min離心10 min，PBS洗滌，棄上液。分別加入100 μL蛋白裂解液裂解30 min，離心取上清，熒光酶標(biāo)儀檢測蛋白濃度。各實(shí)驗(yàn)組蛋白液與等體積上樣緩沖液混勻，煮沸3 min，以15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)印蛋白至硝酸纖維素膜。然后將其放在封閉液中封閉2 h，分別加入鼠抗人cyt-c單克隆抗體、鼠抗人caspase-3單克隆抗體和鼠抗人Livin單克隆抗體，4℃孵育2 h。TBS漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。TBS漂洗3次，用Western blot蛋白質(zhì)印跡（ECL）檢測試劑盒檢測，并用圖像分析軟件分析蛋白條帶的光密度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 UA對HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用

小組合作學(xué)習(xí)是小學(xué)語文課堂教學(xué)中的重要教學(xué)模式之一，在將學(xué)生合理分組后，由教師分配學(xué)習(xí)任務(wù)，學(xué)生以小組為單位，對學(xué)習(xí)任務(wù)進(jìn)行交流、討論，探尋問題的解決方式，最后將學(xué)習(xí)成果進(jìn)行展示，教師和學(xué)生共同進(jìn)行總結(jié)和評價(jià)。在小學(xué)語文課堂教學(xué)中，小組合作學(xué)習(xí)的開展，有助于強(qiáng)化學(xué)生的認(rèn)知，鍛煉學(xué)生的主動探究能力，對于學(xué)生全面發(fā)展具有重要意義。

MTT結(jié)果表明，UA對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29具有增殖抑制作用，并呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性（圖1）。直線回歸方程顯示，UA作用于HT-29細(xì)胞12、24、36、48 h，其IC50值分別為（52.73±1.50）、（43.23±1.94）、（37.39±1.69）、（32.04±1.16）μmol/L。

圖1　不同濃度UA對HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，50 μmol/L的UA作用于HT-29細(xì)胞24 h后，許多細(xì)胞呈現(xiàn)出凋亡的特征性改變，HT-29細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)分布不均勻，呈濃染的塊狀或顆粒狀；而0 μmol/L的UA作用24 h后，HT-29細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)分布比較均勻，呈均勻彌散的藍(lán)白色熒光。壞死細(xì)胞呈紅色熒光（圖2，封三）。

2.3流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率情況

細(xì)胞經(jīng)不同濃度UA作用24 h后，隨著UA濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增高，S期細(xì)胞比例逐漸降低；流式細(xì)胞儀分析顯示，隨著UA濃度的增高，在G1期前出現(xiàn)亞二倍體峰（細(xì)胞凋亡峰）逐漸增高，與0 μmol/L UA比較，凋亡率差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1、圖3。

表1　UA對HT-29細(xì)胞周期及凋亡率的影響（%，x±s）

2.4 Western blot檢測Livin、caspase-3、cyt-c蛋白表達(dá)情況

圖3　不同濃度UA作用24 h后對細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的影響

Western blot結(jié)果顯示，隨著UA濃度（0、20、30、40、50 μmol/L）的增加，Livin蛋白和caspase-3酶原蛋白表達(dá)逐漸降低，而從線粒體中釋放出來的cyt-c逐漸增多，活化后的caspase-3片段的表達(dá)也逐漸升高，與0 μmol/L UA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4　Werstern blot檢測cyt-c、caspase-3和Livin的表達(dá)情況

3　討論

UA在自然界中分布較為廣泛，具有多種多樣的生物學(xué)效應(yīng)，其突出作用是抗腫瘤，它對多種致癌物有抵抗作用，并且對多種惡性腫瘤細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)分化以及抗血管生成作用。因此，人們越來越重視UA的抗癌防癌作用。

本試驗(yàn)研究了UA對于人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的作用，細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明從30 μmol/L起，UA開始較顯著地抑制HT-29細(xì)胞的增殖作用，并呈濃度和時(shí)間依賴性。

PI只能透過壞死的細(xì)胞膜與細(xì)胞核結(jié)合，因此在紫外光激發(fā)下壞死細(xì)胞呈紅色。而Hoechst 33258屬于脂溶性染液，可以通過完整的細(xì)胞膜與靶細(xì)胞的細(xì)胞核結(jié)合，在紫外光的激發(fā)下會發(fā)出藍(lán)白色熒光。若細(xì)胞核染色均勻一致，呈彌散的藍(lán)白色熒光，則是活細(xì)胞；若細(xì)胞核染色不均勻，呈現(xiàn)出濃染的塊狀或顆粒狀，則是凋亡細(xì)胞。本試驗(yàn)中采用Hoechst 33258和PI染色，通過熒光顯微鏡觀察HT-29細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)在50 μmol/L UA作用下，比較多的HT-29細(xì)胞呈現(xiàn)出凋亡的改變，其細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)分布不均勻，在熒光顯微鏡下可看到熒光斑點(diǎn)形成，而0 μmol/L的UA作用24 h后，HT-29細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，染色質(zhì)分布均勻，呈彌散的藍(lán)白色熒光。在兩個(gè)濃度的UA作用下都可以觀察到表現(xiàn)為紅色熒光的壞死細(xì)胞。

通過FCM檢測發(fā)現(xiàn)，UA可以將HT-29細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的G1期，具體表現(xiàn)為G0/G1期的細(xì)胞比例增加，而S期的細(xì)胞比例降低。隨著熊果酸濃度的增加，HT-29細(xì)胞的凋亡率也在逐漸升高，體現(xiàn)在HT-29細(xì)胞的凋亡峰逐漸增高。因此，UA對HT-29細(xì)胞的凋亡作用可能是通過影響HT-29細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而將該腫瘤細(xì)胞阻滯在G1期，減少了HT-29細(xì)胞進(jìn)入S期的數(shù)量，從而抑制了腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制，并導(dǎo)致HT-29細(xì)胞凋亡。

研究表明，腫瘤的發(fā)生和失控性生長是細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡兩個(gè)過程失衡的結(jié)果。參與細(xì)胞凋亡的通路有三條，線粒體通路［9］、死亡受體通路［10］和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路［11］，而線粒體通路中細(xì)胞色素c（cyt-c）是關(guān)鍵的分子。當(dāng)細(xì)胞受到損傷后，cyt-c從線粒體中釋放出來，與凋亡活化因子1（Apaf-1）結(jié)合，并且激活caspase-9的前體，再進(jìn)一步激活caspase-3，引發(fā)caspase的級聯(lián)反應(yīng)，而caspase活化以后又可以促進(jìn)靶細(xì)胞內(nèi)的線粒體釋放cyt-c，同時(shí)其降解底物后的產(chǎn)物可以引起線粒體通透性的改變從而導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡的發(fā)生［12-15］。

在細(xì)胞凋亡的過程中，天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（caspase）發(fā)揮著很重要的作用。根據(jù)caspase在細(xì)胞凋亡中的作用和N-末端的長度，可以將其分成為兩大類：一類是起始型caspase（initiator caspase），如caspase-8、caspase-9，它們可以激活下游的caspase；另一類為效應(yīng)型caspase（effector caspase），如caspase-3、caspase-6、caspase-7，它們可以直接降解靶細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)功能蛋白，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。這些caspase都是以無活性的前體形式存在，需要相關(guān)的激活因子將其激活為活性形式后才能發(fā)揮作用［16］。

在機(jī)體內(nèi)還存在有抗凋亡基因和其相關(guān)表達(dá)產(chǎn)物，凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）就是其中一類，它對于調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡具有重要的作用［17］，某些IAPs成員的異常高表達(dá)可以導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡過程受阻，其中，Livin是近些年來發(fā)現(xiàn)的人類IAP家族的新成員［18］，它與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系［19-21］。研究證實(shí)，IAPs主要通過與特異性的caspase蛋白結(jié)合并抑制caspase蛋白的活性，從而阻斷凋亡的發(fā)生［22-23］。

本研究Western blot結(jié)果表明，UA作用24 h后，隨著藥物濃度的增加，15 kD處cyt-c的釋放增多，caspase-3酶原和Livin蛋白的表達(dá)降低，而活化后的caspase-3片段的表達(dá)逐漸增高。據(jù)此推測，UA有可能通過改變HT-29細(xì)胞內(nèi)線粒體膜的通透性，促進(jìn)cyt-c的釋放，釋放出來的cyt-c進(jìn)而導(dǎo)致caspase-3的活化。同時(shí)，UA還可以下調(diào)HT-29細(xì)胞內(nèi)Livin蛋白的表達(dá)，故UA有可能解除Livin蛋白對caspase-3的抑制作用。上述兩個(gè)過程均可以增強(qiáng)靶細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活化作用，而活化的caspase-3可以作用于HT-29細(xì)胞質(zhì)中的相關(guān)細(xì)胞骨架蛋白，或者是作用于靶細(xì)胞內(nèi)的DNA酶，引起DNA的斷裂，從而導(dǎo)致HT-29細(xì)胞凋亡。

綜上所述，在體外UA可明顯抑制HT-29細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，它的作用機(jī)制可能是通過下調(diào)HT-29細(xì)胞內(nèi)Livin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)線粒體內(nèi)膜中的cyt-c釋放到胞漿中，繼而激活caspase-3，導(dǎo)致靶細(xì)胞的凋亡，其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Research of ursolic acid on proliferation inhibition and apoptosis-inducing in human colon cancer cell HT-29

JIANG Hua1ZHANG Yiying2YIN Sugai1ZHANG Xiaoli1FENG Li1LIU Shengli1ZHANG Qiuping3
1.School of Basic Medicine，He′nan University of Chinese Medicine，He′nan Province，Zhengzhou450046，China；2.Department of ICU，the First Affiliated Hospital of He′nan University of Chinese Medicine，He′nan Province，Zhengzhou450000，China；3.Department of Immunology，Wuhan University School of Medicine，Hubei Province，Wuhan430071，China

R735.3+5

A

1674-4721（2016）09（a）-0025-05

2016-05-16本文編輯：程銘）

張秋萍（1963-），女，博士，教授，主要從事腫瘤免疫學(xué)的研究。