不同劑量脂多糖對(duì)新生SD大鼠的影響

施　展　劉穎穎　武　榮揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淮安市婦幼保健院新生兒醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇淮安223002

不同劑量脂多糖對(duì)新生SD大鼠的影響

施展劉穎穎武榮▲
揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淮安市婦幼保健院新生兒醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇淮安223002

目的觀察腹腔注射不同劑量脂多糖（LPS）對(duì)新生SD大鼠的影響。方法將42只新生SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（n=6）以及實(shí)驗(yàn)組（n=12），實(shí)驗(yàn)組分別為1 mg/kg組、2 mg/kg組、3 mg/kg組。實(shí)驗(yàn)組新生SD大鼠按照1、2、3 mg/kg劑量腹腔注射LPS；對(duì)照組給予等量生理鹽水。觀察24 h各組的一般情況、測(cè)定肺組織濕重/干重（W/D）比值，肺損傷病理評(píng)分，觀察肺組織大體病理情況及肺組織病理學(xué)改變。結(jié)果注射LPS 24 h時(shí)，對(duì)照組肺結(jié)構(gòu)完整、肺泡腔干凈、肺泡隔無(wú)水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，實(shí)驗(yàn)組病理切片可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁和肺間質(zhì)的水腫；各組24 h死亡數(shù)分別是0、0、0和4，4組死亡數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.174，P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組肺組織損傷評(píng)分［（1.91±0.10）、（2.80±0.11）、（5.28±0.39）分］、W/D比值［（1.77±0.07）、（2.98±0.26）、（4.77±0.21）］明顯高于對(duì)照組［（0.71±0.80）分、（1.49±0.21）］，4組在肺組織損傷評(píng)分的兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 699.761，P＜0.05）。4組在W/D比值的兩兩比較，除了對(duì)照組和1 mg/kg組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=587.936，P＜0.05）。結(jié)論給予新生SD大鼠腹腔注射不同劑量LPS（2 mg/kg和3 mg/kg）24 h內(nèi)均可制作ALI模型。其中2 mg/kg誘導(dǎo)的大鼠肺損傷模型死亡率低，可以大量、快速地建模。

脂多糖；肺損傷；模型；新生鼠

［Abstract］Objective To observe the effect of newborn SD rats by intraperitoneal injection in different doses of lipopolysaccharide（LPS）.Methods 42 newborn Sprague-Dawley（SD）rats were divided into the control group（n=6）and the experiment groups（n=12）according to the random number table method.The experiment groups were divided 1 mg/kg group，2mg/kg group and 3mg/kg group；the experiment groups intraperitoneal injection of 1 mg/kg，2 mg/kg and 3 mg/kg LPS respectively；the control group were received the same volume saline injection.The general situation，wet weight/dry（W/D）weight ratio of lung，lung injury score and pathological changes of lung tissue at 24 hours in each group were observed.Results 24 hours after LPS injection，the control group lung structure was intact，alveolar cavity was clean，no edema and inflammatory cell infiltration were exist，the experiment group lung inflammatoty cell infiltration and interstitial edema were found；The mortality of groups at 24h were 0，0，0，4；There was significant differences in mortality between the control group and the experiment group（χ2=7.174，P＜0.05）；At experiment groups，the lung injury score［（1.91±0.10），（2.80±0.11），（5.28±0.39）］，the W/D ratios of lung tissue［（1.77±0.07），（2.98±0.26），（4.77± 0.21）］were significantly higher than those in the control group［（0.71±0.80），（1.49±0.21）］.There was significant differences in the lung injury score between the control group and the experiment groups（F=699.761，P＜0.05）.There was significant differences in the W/D ratios of lung tissue between the control group and the experiment groups（F= 587.936，P＜0.05），except for the control group and 1 mg/kg group（P＞0.05）.Conclusion It can be successfully established ALI model of newborn SD rats by intraperitoneal injection of different doses of LPS（2 mg/kg and 3 mg/kg）in 24h.2 mg/kg induced ALI model is with low mortality，it can be used to large and rapid establish ALI model.

［Key words］Lipopolysaccharide；Lung injury；Animal model；Newborn rat

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全，流行病學(xué)調(diào)查顯示ALI是臨床常見(jiàn)危重癥，病死率較高［1］。脂多糖（Lipolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌（G-）細(xì)胞壁上的一種結(jié)構(gòu)成分，革蘭陰性桿菌感染致急性肺損傷，主要是由于LPS活化炎性細(xì)胞釋放大量炎癥因子所致［2］。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［3］，LPS引起肺功能改變?cè)? h達(dá)到頂峰，組織學(xué)切片顯示主要的特征是炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡隔增厚，在2 h顯現(xiàn)，并在24 h達(dá)到峰值。因此造模時(shí)間最好限制在24 h內(nèi)，此階段是肺損傷炎癥階段的高峰期，而在此之后大多數(shù)ALI動(dòng)物模型肺部炎癥基本消退。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)SD大鼠42只，日齡10 d，體重（18±2）g，雌雄各半。由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：scxk（皖）2011-002。在光照-黑暗各交替12 h，相同溫度、濕度條件下，由母鼠自由喂養(yǎng)。

1.2分組及處理

按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（n=6）和實(shí)驗(yàn)組（n= 12）。后者進(jìn)一步分為1、2、3 mg/kg的亞組。實(shí)驗(yàn)組分別給予1、2、3 mg/kg不同劑量的LPS，最后定容為0.2 mL腹腔注射；對(duì)照組給予等容量的生理鹽水腹腔注射。

1.3藥品

LPS（EcoliO55B5）購(gòu)自美國(guó)sigma公司。

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，中國(guó)的老齡化趨勢(shì)日益加劇，老齡化問(wèn)題也成為了人群之中的熱點(diǎn)，其中較為突出的問(wèn)題就是老人的護(hù)理問(wèn)題，作為一名護(hù)理本科生，我平時(shí)接觸最多的就是醫(yī)院中的病人，而在這其中老人則是一個(gè)特殊又普遍的群體，在平常的見(jiàn)習(xí)課程中我也會(huì)和老人們進(jìn)行溝通并且對(duì)于一些我所觀察到的現(xiàn)存護(hù)理問(wèn)題進(jìn)行思考，在經(jīng)過(guò)了兩年的見(jiàn)習(xí)課程后，我有了更多的收獲。所以在這里，我想要把我自己護(hù)理見(jiàn)習(xí)的體會(huì)和建議記錄下來(lái)，同時(shí)希望自己在將來(lái)養(yǎng)老問(wèn)題的解決上做一點(diǎn)貢獻(xiàn)。

1.4動(dòng)物樣品收集

于24 h時(shí)觀察成活率并處死，立即打開(kāi)胸腔，取右肺上葉做組織學(xué)檢查。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.5肺組織病理觀察

1.5.1大體觀察按照文獻(xiàn)方法分為5級(jí)［7］：Ⅰ級(jí)，正常肺；Ⅱ級(jí)，肺較飽滿(mǎn)，有水腫；Ⅲ級(jí)，點(diǎn)狀肺出血，整個(gè)肺可見(jiàn)針尖或綠豆大小的出血；Ⅳ級(jí)，局灶性肺出血，肺表面有總面積小于2葉的小灶或小片狀出血；Ⅴ級(jí)，彌散性肺出血，肺表面可見(jiàn)總面積達(dá)2葉以上的斑塊狀或大片狀暗紅色出血。

1.5.2組織學(xué)檢查取右肺上葉組織，經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、HE染色后，光鏡下觀察。主要依據(jù)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡水腫、肺間質(zhì)水腫、肺泡出血、透明膜形成、肺不張等的程度累計(jì)總分，按程度的“無(wú)、輕、中、重”分別計(jì)“0、1、2、3分”。每只動(dòng)物分別切取4張切片，每張切片觀察不重疊的10個(gè)視野，分別記錄病理學(xué)評(píng)分的值［8］。4張切片的平均值即代表該大鼠的病理學(xué)評(píng)分。

1.6肺組織濕重/干重（W/D）比值測(cè)定

取右肺上葉稱(chēng)濕重（W）后，放置80℃恒溫烤箱進(jìn)行48 h烘烤，再稱(chēng)干重（D），計(jì)算濕/干重（W/D）比值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率，多組間計(jì)量資料比較采用One-way ANOVA分析，方差齊時(shí)，兩兩比較使用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，用Tamhane′s T檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1呼吸頻率及死亡率的變化

動(dòng)物致傷后出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡、呼吸急促或呼吸困難等表現(xiàn)，隨著LPS劑量增大，呼吸困難程度加重。致傷后6 h，部分動(dòng)物口鼻偶見(jiàn)血性泡沫。24 h時(shí)對(duì)照組和1、2 mg/kg組全部成活；3 mg/kg組死亡4只，死亡率為33.3%。4組比較，死亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

2.2肺組織大體病理改變

對(duì)照組動(dòng)物肺外觀色澤粉紅，無(wú)明顯異常改變。LPS致傷后，肺體積增大，臟層胸膜張力較高，色澤暗紅，可見(jiàn)包膜下點(diǎn)、片狀出血，切面疏松，有黃色或淡紅色液體溢出。LPS劑量越大，新生大鼠肺水腫等病變?cè)街亍? mg/kg組肺大體觀察屬Ⅱ級(jí)；2 mg/kg組肺大體觀察屬Ⅱ～Ⅲ級(jí)；3 mg/kg組肺大體觀察屬Ⅲ～Ⅳ級(jí)，當(dāng)LPS=3 mg/kg時(shí)，易見(jiàn)出血等改變。

2.3組織學(xué)檢查

對(duì)照組動(dòng)物肺組織HE染色光鏡下可見(jiàn)肺結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔干凈，肺泡隔無(wú)水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁無(wú)增厚；LPS致傷后，主要病變?yōu)檠装Y細(xì)胞大量向肺泡腔內(nèi)滲出；肺間質(zhì)、肺泡水腫，肺泡隔增厚；肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞浸潤(rùn)、粉紅色液體滲出。當(dāng)LPS 1、2 mg/kg時(shí)，可見(jiàn)炎性細(xì)胞滲出逐漸增多、肺泡間隔水腫且逐漸增厚，LPS 1、2 mg/kg組肺組織損傷評(píng)分比較，對(duì)照組較高（P＜0.05）；當(dāng)LPS 3 mg/kg時(shí)，炎細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫以及出血等病變均加重，LPS 3 mg/kg組肺組織損傷評(píng)分比對(duì)照組顯著增高（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。

圖1　24h時(shí)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組病理切片HE染色（×400）

表124　 h時(shí)肺組織損傷評(píng)分和W/D比值的變化（x±s）

2.4肺組織W/D比值的變化

腹腔注射LPS可使新生SD大鼠肺組織W/D比值增加，且肺組織W/D比值隨著劑量的增大而增加；LPS=3 mg/kg時(shí)，肺組織W/D值顯著高于低劑量組。見(jiàn)表1。

3　討論

急性肺損傷是由多種炎癥介質(zhì)及效應(yīng)細(xì)胞共同參與的，并呈級(jí)聯(lián)放大的瀑布樣炎癥繼發(fā)性損傷與繼發(fā)性彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷。為更好地模擬臨床疾病的病理過(guò)程以及為進(jìn)一步研究疾病的病理機(jī)制，建立相應(yīng)的動(dòng)物模型是非常必要的。ALI的致病因素很多，根據(jù)不同誘因，可以復(fù)制出不同動(dòng)物模型。模型動(dòng)物的可選擇種類(lèi)也相當(dāng)廣泛，包括大鼠、小鼠、兔、犬、豬、綿羊、山羊及靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物等［9］。與其他一些物種相比（如豬、羊），鼠類(lèi)對(duì)LPS高度抵抗，這樣大劑量的LPS也必然引起肺部反應(yīng)［10］。目前誘導(dǎo)成年和新生大鼠肺損傷模型的方法有很多種，如LPS、長(zhǎng)期暴露在高氧環(huán)境、機(jī)械通氣、油酸靜脈注射、銅綠假單胞菌、病毒感染、硫脲、吸入海水和博來(lái)霉素導(dǎo)致ALI等［11］。炎癥是急性肺損傷重要的發(fā)病機(jī)制［12］。G-所致敗血癥是引發(fā)新生兒ALI和死亡的重要原因之一，因此，建立LPS致急性肺損傷模型，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)，也對(duì)臨床ALI防治具有重要意義［13-14］。

本研究結(jié)果顯示，LPS組可見(jiàn)肺體積增大，可見(jiàn)包膜下大小不等的點(diǎn)、片狀出血，切面呈紅色肝樣變；光鏡下主要表現(xiàn)為間質(zhì)及肺泡腔有廣泛出血、水腫、滲出、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)和肺泡隔增厚。與相關(guān)的研究結(jié)果一致［15-16］。肺W/D反映了肺水腫的情況，在本實(shí)驗(yàn)中，LPS組肺W/D隨劑量的增加逐漸增加，表明肺水腫情況逐漸加重。這也反映了肺血管通透性的改變，表明血管通透性增加，這與肺損傷分子機(jī)制中肺間質(zhì)及肺泡水腫等一致。

在探討脂多糖致大鼠急性肺損傷模型取材時(shí)間中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示選擇尾靜脈注射10 mg/kg脂多糖在6 h時(shí)可成功復(fù)制大鼠急性肺損傷模型［17］。大鼠尾靜脈注射5 mg/kg在2 h時(shí)可成功復(fù)制大鼠的ALI模型［18］。氣管內(nèi)滴注LPS 8 mg/kg，12 h后亦可建立大鼠ALI模型［19］。氣管內(nèi)灌注LPS 0.5 mL/kg（20 μg/mL）能成功地建立ALI動(dòng)物模型［20］。何征宇等［21］采用小劑量LPS對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)腹腔注射的方法，成功制作了LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI和肺纖維化的動(dòng)物模型。

本研究發(fā)現(xiàn)，梯度劑量LPS可以引發(fā)程度不同的新生大鼠ALI。1 mg/kg組炎細(xì)胞浸潤(rùn)范圍小，無(wú)水腫和出血等病變，肺損傷較小，24 h死亡率為0，在24 h內(nèi)未達(dá)到肺損傷的標(biāo)準(zhǔn)，因此不適合作為研究24 h內(nèi)新生大鼠ALI模型的劑量；3 mg/kg病理顯示肺損傷較嚴(yán)重，可見(jiàn)水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及出血等病變，肺水含量顯著高于低劑量組，24 h死亡率為33.3%，由于死亡率較高，因此也不適合作為研究24 h內(nèi)新生大鼠ALI模型的劑量；2 mg/kg組肺損傷程度適中，24 h的死亡率為0，適合作為研究24 h內(nèi)新生大鼠ALI模型的劑量。

綜上所述，選用不同劑量LPS（2 mg/kg和3 mg/kg）對(duì)新生SD大鼠腹腔注射，在24 h內(nèi)均可制作ALI模型。其中2 mg/kg劑量誘導(dǎo)的大鼠肺損傷模型死亡率低，可以大量、快速地建模。

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Lipolysaccharide-induced acute lung injury in newborn rats

SHI ZhanLIU YingyingWU Rong▲
Neonatal Medical Laboratory，Huai′an Maternity and Child Healthcare Hospital Affiliated to Yangzhou University Medical Academy，Jiangsu Province，Huai'an 223002，China

R722.1

A

1674-4721（2016）09（a）-0034-04

2016-05-20本文編輯：趙魯楓）

江蘇省婦幼保健重點(diǎn)人才基金項(xiàng)目（FRC201211）。