人精子頂體內頂體蛋白酶和透明質酸酶對男性生育力的影響

馬曉萍，高曉勤，楊燕平，楊 喆

(1.遵義醫藥高等專科學校組織胚胎學教研室，貴州遵義563002;2.貴陽醫學院組織胚胎學教研室，貴州貴陽550004)

常規精液分析一直是評價男性生育力的主要實驗室手段，但對全面了解和提示精子使卵子受孕的能力尚顯不足。精子形態、密度、活動率是受精過程中重要的參數之一，與頂體內酶系有十分密切的關系[1]。精子是個形態特殊的細胞，頭端有一染色致密濃縮的細胞核，前端覆蓋有頂體，內含有多種溶酶體酶，其中以頂體蛋白酶(acrosome enzyme，ACE)及透明質酸酶(hyaluronidase，HYD)與受精關系最為密切[2]，在精子受精過程中起著非常重要的作用。二者協同檢測，可作為判斷男性生育能力的指標[3]。已有文獻報道運用改良底物膜法檢測不育男性精子HYD活性與精液參數的關系[4]，但同時對頂體內2種受精關鍵酶—ACE活性與HYD活性檢測與精液參數的關系報道較少。我們應用細胞化學染色技術，利用精子ACE能溶解蛋白質和精子頂體內HYD能溶解卵丘基質的透明質酸的酶學特性，選用改良明膠底物膜法[3]和改良透明質酸鈉-明膠底物膜法[5]，在光鏡下分別觀測不育癥患者精子ACE活性(ACE陽性反應率、ACE活性強度)和HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)，分析不育癥患者精子頂體內HYD、ACE活性與精液常規參數的關系，以探討其與男性生育力的影響。

材料和方法

一、對象

選擇貴陽醫學院附屬醫院生殖檢驗中心不育癥患者52例，年齡24～30歲，均為已婚同居2年以上，性生活正常且排除女方不育原因者。以12名有生育能力的自愿獻精者作為正常生育組，年齡24～30歲。

二、主要儀器及試劑

Anke-GL-16 G-Ⅱ型高速冷凍離心機(上海安亭儀器廠)，SPX-150C型恒溫恒濕箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)，Sartorius BS2103電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)，偉力WLJY9000彩色精子質量檢測系統(北京偉力新世紀科技發展有限公司)，Mias攝影圖象分析系統(上海天程科技有限公司)。

三、方法

1.標本來源 受試者禁欲3～5 d，用新潔爾滅消毒手及尿道口，以手淫法獲取1次全部精液，放入一次性無菌干燥帶蓋塑料容器內，置37℃恒溫水浴箱中，孵育30 min，待完全液化后，以偉力WLJY9000彩色精子質量檢測系統對每份標本進行臨床精液常規檢查及計算機輔助精液分析(CASA)，觀察精子密度、精子活動率、精子畸形率等指標。

2.分組 依據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)標準將52例不育癌患者按精子密度不同分為 B1(＞40×109/L)、C1[(20～40)×109/L]及D1(＜20×109/L)3組;按精子活動率不同分為B2(＞50%)、C2(30% ～50%)及D2(＜30%)3組。正常生育組精子密度為(50～100)×109/L，精子活動率為60% ～90%。

3.標本處理 精液以900×g離心10 min，棄上層精漿，下層沉淀物以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，并懸浮于2倍以上PBS中，分作雙份備用。將上述PBS精子懸浮液1、2滴分別涂于改良明膠底物膜片[4]和改良透明質酸鈉-明膠底物膜片[5]上，置于37℃恒溫恒濕箱孵育，3 h后取出，室溫下干燥，于普通光鏡下觀察孵育結果。

四、觀察指標

1.ACE或HYD陽性反應率 終止孵育后，每份孵育片于Leica DME光學顯微鏡下均勻選取5～6個視野，隨機觀察200個精子頭部，出現周圍暈環者視為ACE或HYD陽性。

2、ACE或HYD活性強度 采用測微尺測量視野下每個精子頭部暈環直徑的大小，取其平均值作為判斷ACE或HYD活性強度的指標。

五、統計學分析

結 果

一、精子ACE、HYD活性與精子密度、活動率、形態畸形率之間的關系

對全部64份標本的精子ACE、HYD活性與精子密度、活動率、形態畸形率進行相關分析。結果顯示精子ACE活性(ACE陽性反應率、ACE活性強度)與精子密度、活率、畸形率呈明顯相關[相關系數(r)分別為 0.797、0.867，0.831、0.860和 －0.625、－0.546，P 均 ＜0.01];精子 HYD 活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)與精子密度、活率、形態畸形率呈明顯相關[r值分別為0.832、0.855，0.842、0.830 和 － 0.625、－ 0.554，P 均 ＜0.01]。

二、正常生育組與不育組精子ACE、HYD活性分析

不育組精子形態畸形率明顯高于正常生育組(P＜0.01);而ACE活性(ACE陽性反應率、ACE活性強度)及HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)則明顯低于正常生育組(P＜0.01)。見表1。各組ACE活性(ACE陽性反應率、ACE活性強度)和HYD活性(HYD陽性率、HYD活性強度)見圖1～圖4。

表1 正常生育組和不育組精子形態畸形率及精液ACE、HYD活性結果

三、正常生育組與不同精子密度不育組ACE、HYD活性的分析

C1、D1組ACE活性(ACE陽性反應率、ACE活性強度)及HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)明顯低于正常生育組(P＜0.01)，各組酶活性隨精子密度增加而上升，見表2。

表2 正常生育組和不同精子密度不育組精子ACE、HYD活性比較

四、正常生育組與不同精子活動率不育組ACE、HYD活性分析

C2、D2組ACE活性(ACE陽性反應率、ACE活性強度)及HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)明顯低于正常生育組(P＜0.01);各組酶活性隨精子活動率增加而上升。見表3。

表3 正常生育組和不同精子活動率不育組精子ACE、HYD活性比較

圖1 正常生育組精子ACE陽性反應率及活性強度

圖2 正常生育組精子平均HYD陽性反應率及活性強度

圖3 不育組精子ACE陽性反應率及活性強度

圖4 不育組精子HYD陽性反應率及活性強度

討 論

精子頂體內含有人類已知的24種酶，其中以ACE及HYD與受精關系最為密切[2]。當精子獲能時，頂體釋放ACE水解卵子透明帶，能使精子順利的通過[6]。HYD是一種重要的精子頂體酶，能使含有透明質酸的卵丘解，卵泡周圍的顆粒細胞分散，便于精子通過[7]。在頂體蛋白酶及其他酶系的密切配合下，為精卵融合、形成受精卵創造條件。因此，測定精子ACE、HYD活性是評價精子功能的重要指標。二者協同檢測可作為判斷男性生育能力的指標[3]。在以往對精子頂體內酶的研究方法中，多數是以生化法檢測整份標本中全部精子的ACE活性、HYD活性及頂體反應率。而本研究運用固定明膠底膜法[3]和改良透明質酸鈉-明膠底物膜法[5]來分別檢測精子頂體內ACE活性、HYD活性，能反映單個精子內ACE、HYD活性的強弱及陽性率的高低，比以往生化檢測法更具臨床優勢及實用性。精子頭部亮環直徑的大小和亮度的強弱可以反映出精子所含ACE、HYD量的多少和酶活性的高低;而酶活性陽性反應率的高低則反映了精子有受精能力百分比的高低。本研究結果表明精子ACE活性(ACE陽性反應率、ACE活性強度)及HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)與精子密度、活動率和畸形率呈明顯相關。不育組精子ACE活性(ACE陽性反應率、ACE活性強度)及HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)隨精子密度及活動率減低而下降，并隨精子畸形率的升高而下降。正常生育組精子ACE、HYD陽性反應率及活性強度等指標均優于不育組。精子頂體內酶的活性首先依賴于頂體的完整狀態[8]。畸形及活力差的精子其頂體也常為畸形，引起頂體內酶系流失，導致不育。

綜上所述，精子ACE、HYD活性可作為一種有效的判斷生育力的指標。在進行精液常規檢驗的基礎上，再進行精子頂體內酶活性的觀察，有利于提高臨床男性不育的診斷水平。本研究采用的檢測方法操作簡便易行，結果準確可靠，可以測定單個精子頂體內ACE、HYD活性。在以往對精子頂體內酶的研究方法上再結合本研究方法共同分析精子頂體內酶對生育力的影響，可為男性不育癥的診斷、治療及病情觀察提供重要理論依據。

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