多種分離方法分離臍血造血細胞效率的比較

王丹丹 林瑩 武文杰 李茜

摘 要：目的：比較多種分離方法分離臍血造血細胞的效率。方法：依據隨機方法將133例臍血標本分為3組，A組選擇HES法，B組選擇Ficoll法，C組選擇明膠法。所有標本均進行CD34+細胞檢測，同時進行造血祖細胞體外培養。結果：A組CD34+細胞產率明顯高于B組，C組CD34+細胞產率明顯高于B組，A組CD34+細胞產率明顯C組，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）；A組CFCs產率明顯高于B組，C組CFCs產率明顯高于B組，A組CFCs產率明顯C組，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）。結論：在分離臍血造血細胞過程中，HES法的分離效率高于HES法、明膠法。

關鍵詞：臍血造血細胞；HES法；Ficoll法；明膠法；效率

臍血造血細胞分離是臍血移植過程中的重要環節，也是臍血庫建立的關鍵性步驟，對血液病患者的疾病治療有著重要的作用。目前，最常見的臍血造血細胞分離方法為HES法、Ficoll法、明膠法，其中HES法的分離效率較高，其體積濃縮效果較好。本研究將133例臍血標本分為3組，3組分別應用HES法、Ficoll法及明膠法，比較3組的分離效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共133例臍血標本，均由我市某醫院婦產科提供，臍血標本采集量50.2-140.5ml，平均81.7ml。標本采集后保存于4℃的溫度條件下，保存時間控制在24h之內。依據隨機方法，將133例臍血標本分為3組，A組45例，B組44例，C組44例。

1.2 方法

1.2.1 HES法

A組45例標本選擇HES法，即在整份臍血中加入25%的羥乙基淀粉60g/L，混合均勻后進行500r/min離心處理，時間控制在5min，之后去掉紅細胞，再進行1200r/min離心處理，時間控制在13min，將部分血漿去掉，確保體積濃縮至25ml左右，最后將白細胞重懸在剩余的血漿中。

1.2.2 Ficoll法

B組44例標本選擇Ficoll法，即選擇Ficoll 10ml，相對密度為1.077，將其置于離心管（50ml）中。每例標本取10ml臍血，并置于液面上，之后進行1800r/min離心處理，時間控制在10min，選擇白細胞層重懸在RPMI 1640培養液10ml中。

1.2.3 明膠法

C組44例標本選擇明膠法，即從44例標本中順利取出20ml，并放置于離心管（50ml）與30g/L明膠（20ml）中，混合均勻后，進行30min沉降處理，之后將上清液置于另一個離心管（50ml）中，添加50% 30g/L明膠，進行30min沉淀處理，保留上清液。

1.2.4 CD34+細胞檢測

抗體主要選擇美國Pharmigen公司生產的抗人CD34抗體，同時選擇美國BectonDick-inshon公司生產的流式細胞儀進行檢測。將抗體20μl置入臍血100μl中，混合均勻后在4℃溫度條件下進行30min孵育，選擇氯化銨裂解紅細胞，時間控制在30min，之后進行兩次PBS洗滌，選擇多聚甲醛進行固定后再實施檢測，同時開淋巴細胞窗。

1.2.5 造血祖細胞體外培養

選擇體外培養方法，培養體系主要選擇甲基纖維素半固體培養基，其包括四個成分，即白細胞介素-3（10ng/ml）、粒細胞集落刺激因子（200ng/ml）、干細胞因子（50ng/ml）、紅細胞生成素（1U/ml）。選擇2×105個有核細胞，將其置于2ml培養體系中，并在體積分數保持在5% CO2、溫度保持在37℃基礎上進行14d的培養，之后分別計數BFU-E、CFU-GM以及CFU-Mix，同時準確計算出三者之和，即CFCs[1]。

1.3 統計學方法

選擇SPSS10.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，選擇ANOVA與 Bonferroni 兩兩比較方法進行分析，當P<0.05時表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD34+細胞產率

A組分離前CD34+細胞為（8.81±1.90）×107，分離后CD34+細胞為（8.67±1.67）×107，產率為（98.15±5.68）%；B組分離前CD34+細胞為（1.08±0.40）×107，分離后CD34+細胞為（0.36±0.01）×107，產率為（32.85±4.77）%；C組分離前CD34+細胞為（2.17±0.69）×107，分離后CD34+細胞為（2.08±10.36）×107，產率為（81.46±5.93）%。A組CD34+細胞產率高于B組，C組CD34+細胞產率高于B組，A組CD34+細胞產率高于C組，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 CFCs產率

A組分離前 CFCs為（2.41±0.31）×106，分離后CFCs為（2.20±0.33）×106，產率為94.56%；B組分離前 CFCs為（3.07±0.40）×105，分離后CFCs為（9.57±0.86）×104，產率為30.87%；C組分離前 CFCs為（5.88±0.81）×105，分離后CFCs為（5.22±0.58）×105，產率為78.49%。A組CFCs產率高于B組，C組CFCs產率高于B組，A組CFCs產率高于C組，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

臍血是臨床醫學中重要的造血干細胞來源，其可以替代骨髓實施造血干細胞移植，在血液疾病治療中發揮重要的作用。在臍血移植及臍血庫建立中，臍血干細胞分離技術起著積極性的作用，科學、有效的分離技術可以快速分離臍血中的有核細胞，為臍血庫的建立奠定基礎[2]。

Ficoll法、明膠法、HES法是目前科研中廣泛應用的臍血干細胞分離方法，不同的分離方法，其對造血細胞回收所產生的影響也有所不同，分離效率也不盡相同。運用Ficoll法進行分離，CD34+細胞損失超過60%以上，干細胞丟失嚴重，且每次僅可分離出較少的臍血量，在臍血庫建立中存在一定的局限性。應用明膠法分離時，CD34+細胞損失率低于Ficoll法，CFCs損失率也比較低，對臍血庫建立非常有利，但經明膠分離后，終體積所占的比率比較大，約為原體積的75%。HES法具有操作簡單、用時少、分離效率高、體積濃縮效果好等多種優點，其CD34+細胞損失率通常不超過5%，CFCs損失率通常不超過10%，且其分離后終體積所占的比率比較小，通常不超過原體積的25%。本研究將133例臍血標本分為3組，A組應用HES法，B組應用Ficoll法，C組應用明膠法，結果顯示，A組CD34+細胞產率及CFCs產率均高于B組、C組，證實HES法分離臍血造血細胞的效率高于Ficoll法、明膠法。

綜上所述，在分離臍血造血細胞中，HES法分離效率較高，其分離效果優于Ficoll法與明膠法，有助于臍血庫建立，是分離臍血造血細胞首選的方法，值得推廣。

參考文獻

[1]王穎超，殷楚云，馮磊，等.三種不同方法分離臍血造血干細胞的效果比較[J].實用兒科臨床雜志，2012，27（10）：766-768+794.

[2]陳林，張坤，邵文陶，等.臍帶血造血干細胞分離凍存方法優化[J].重慶理工大學學報（自然科學），2014，28（12）：82-86.