基于核酸適配體的熒光法檢測水胺硫磷和丙溴磷

王麗 葉華 桑宏慶 王丹丹

摘要：建立了基于適配體的農藥水胺硫磷和丙溴磷的熒光檢測方法。采用可特異性識別水胺硫磷和丙溴磷、且5′ 端標記熒光基團FAM的核酸適配體（FssDNA），與3′ 末端標記猝滅基團DABCYL的短鏈序列（QssDNA）互補雜交形成雙鏈結構，熒光基團的熒光被淬滅，熒光信號很弱；此時加入靶分子，特異性結合核酸適配體，引起互補短鏈序列從雙鏈結構中解離，使適配體熒光信號增強，基于此可實現水胺硫磷、丙溴磷的定量檢測。優化后的檢測條件為：將終濃度為25 nmol/L FssDNA與50 nmol/L QssDNA在25℃孵育20 min，使二者雜交形成雙鏈適配體探針復合物，加入等體積的農藥樣品孵育60 min，然后檢測體系的熒光信號變化值ΔI。在最佳條件下，ΔI與水胺硫磷和丙溴磷的濃度均在50～500 μmol/L范圍內呈線性關系。水胺硫磷的檢出限（LOD，3σ）為11.4 μmol/L，相對標準偏差 （RSD）為5.8%（n=10）；丙溴磷的檢出限為14.0 μmol/L，RSD為4.9%（n=10）。用于實際水樣中兩種農藥的檢測，加標回收率為85.8%～95.3%

關鍵詞 ：核酸適配體； 熒光； 水胺硫磷； 丙溴磷

1 引 言

水胺硫磷（Isocarbophos）是一種速效廣譜的有機磷殺蟲劑，主要用于防治果樹、水稻和棉花害蟲，禁止用于果、茶、煙、菜、中草藥植物，屬于高毒農藥，對人畜的危害很大，主要通過食道、皮膚和呼吸道引起中毒[1，2]。丙溴磷（Profenofos）是一種中等毒性的非內吸性廣譜有機磷殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用，對棉花、果樹、水稻、蔬菜等作物上的害蟲有很好的防治效果[3，4]。我國規定在谷物中水胺硫磷最大殘留限量為0.1 mg/kg，丙溴磷在柑橘和結球甘藍中最大殘留限量分別為0.2和0.5 mg/kg[5]。目前，水胺硫磷和丙溴磷的準確定量分析主要采用色譜法和色譜質譜聯用法，這些方法靈敏度和準確度較好，但前處理復雜，需要昂貴的儀器以及專業人員操作，不適合基層分析實驗室的推廣應用。因此，開發新的農藥殘留檢測技術十分必要。

核酸適配體（Aptamer）[6，7]是通過指數富集配體系統進化技術（SELEX）從體外合成的寡核苷酸庫中篩選得到的，能與靶分子特異性結合寡核苷酸序列，具有靈敏度高、親和力強、識別靶分子范圍廣、特異性好、易合成等優點，在藥物篩選、藥物檢測、疾病診斷、食品分析等方面得到了廣泛應用[8，9]。目前，在食品安全領域，通過與納米材料、電化學、熒光技術等結合，適配體已成功應用于抗生素、生物毒素、重金屬等的檢測分析[10～17]。在前期的研究中，本課題組利用SELEX技術成功篩選了兩條識別甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂果的核酸適配體[18]，并對兩條核酸適配體的進行了改造，改造后的SS24PJ35 適配體對水胺硫磷和丙溴磷表現出了較高的活性[19]。本研究利用前期改造的SS24PJ35 適配體，采用高靈敏的熒光檢測技術，初步建立了檢測水胺硫磷和丙溴磷的方法。本方法簡單、快速、成本低、需樣量少，對水胺硫磷和丙溴磷具有較高的特異性，適用于水胺硫磷和丙溴磷農藥制劑及高含量農藥多殘留的快速檢測。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Filter Max F3多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；Costar黑色96孔板（美國Costar公司）；LX100手掌性離心機（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；WH2微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；PHS3B精密pH計（上海虹益儀器有限公司）；TGL16臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

水胺硫磷、丙溴磷、甲拌磷、氧化樂果、馬拉硫磷、辛硫磷、甲基對硫磷標準品（上海市農藥研究所）；核酸適配體序列：5′FAMAGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT3′（FssDNA），互補雜交序列：5′CAAGAATCGCTGCAGDABCYL3′（QssDNA1），5′GAATCGCTGCAGCAADABCYL3′（QssDNA2），5′TCGCTGCAGCAAGCTDABCYL3′（QssDNA3）（上海生工生物工程股份有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度≥99.9%，美國Sigma公司）；其它試劑均為國產分析純；實驗用水為超純水。緩沖溶液1×Buffer：300 mmol/L NaCl，50 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，50 mmol/L Tris，pH 8.3。

2.2 實驗方法

2.2.1 QssDNA的選擇 針對FssDNA序列設計了3條不同雜交部位的互補序列QssDNA1、QssDNA2、QssDNA3，在100 μL含0.5%丙酮的1×Buffer緩沖體系中，分別測定 FssDNA、FssDNA+QssDNA、FssDNA+QssDNA+水胺硫磷、FssDNA+QssDNA+丙溴磷的熒光強度，實驗采用黑色96孔板，在Filter Max F3多功能酶標儀上測定熒光信號，激發波長485 nm，發射波長535 nm。其中， FssDNA、QssDNA的終濃度均為25 nmol/L，水胺硫磷、丙溴磷的終濃度均為0.5 mmol/L，25℃下，FssDNA和QssDNA先避光孵育20 min，然后再與農藥孵育40 min，進行3組平行實驗。

2.2.2 FssDNA與最適QssDNA雜交條件的優化 實驗對FssDNA與2.2.1小節篩選的最適QssDNA雜交的添加比例、孵育時間、孵育溫度進行了優化。具體操作步驟：取若干1.5 mL離心管，加入26 μL 100 nmol/L FssDNA，再分別加入26 μL一定濃度的最適QssDNA，振蕩混勻，在一定溫度下避光孵育一段時間，制備適配體探針復合物。然后加入52 μL 1 mmol/L 農藥（含1%丙酮的1×Buffer緩沖溶液），常溫下避光孵育40 min，同時以52 μL含有 1%丙酮的1×Buffer緩沖溶液作為對照，進行3組平行實驗。取100 μL反應液于黑色96孔板中測定熒光強度，對照組的熒光強度為I0，農藥組的熒光強度為I，熒光強度變化ΔI=I-I0。

2.2.3 樣品的測定 采集安徽科技學院人工湖水，經0.22 μm濾膜過濾后，配制成含有一定濃度農藥（含1%丙酮的1×Buffer緩沖體系）的水樣，在優化的實驗條件下進行測定，計算回收率。

3 結果與討論

3.1 實驗原理

檢測原理見圖1。在適配體5′ 末端標記FAM熒光基團，設計了一段與適配體互補雜交的序列，并在3′ 末端標記淬滅基團DABCYL。當適配體與互補序列雜交形成雙鏈時，熒光基團與淬滅基團在空間上接近，發生熒光能量共振轉移，體系熒光信號很弱。當水胺硫磷、丙溴磷特異性識別結合適配體，形成特定的空間結構時，適配體與互補序列解離，導致熒光信號增強。因此可利用熒光強度的變化檢測靶分子。

3.2 不同QssDNA序列的影響

本實驗針對FssDNA序列，設計了3條與適配體不同部位雜交的互補序列QssDNA1、QssDNA2、QssDNA3，考察了不同序列對測定結果的影響， 如圖2所示。3條QssDNA序列與FssDNA結合后，體系熒光強度均發生不同程度的降低，當加入水胺硫磷、丙溴磷農藥時，熒光強度又有不同程度的回升。其中QssDNA2對FssDNA的熒光淬滅效果最好，且加入農藥后，QssDNA2組的熒光強度變化最大。原因可能是QssDNA1的雜交位點從FssDNA 5′末端第7個堿基開始，淬滅基團與熒光基團離的相對較遠；QssDNA3的雜交位點從第1個堿基開始，理論上淬滅基團與熒光基團離得最近，但可能由于標記基團本身的空間位阻效應，雜交效果并不理想，熒光強度下降最小；QssDNA2的雜交位點從第4個堿基開始，淬滅基團與熒光基團距離適中，熒光強度下降最大。因此選擇QssDNA2作為雜交序列。

3.3 FssDNA與QssDNA2的比例的優化

固定 FssDNA終濃度為25 nmol/L，按照1∶1.0， 1∶1.5， 1∶2.0， 1∶2.5和1∶3.0的濃度比例添加QssDNA2，考察對體系熒光強度的影響。實驗發現， 對于兩種農藥，隨著QssDNA2添加比例的增加，ΔI都逐漸增加，當比例達到1∶2之后ΔI開始降低，尤其丙溴磷組的ΔI下降明顯。可能是當QssDNA2的濃度過大時，影響了農藥與FssDNA的識別結合。因此確定FssDNA與QssDNA2最佳添加比為1∶2，即FssDNA終濃度為25 nmol/L，QssDNA2終濃度為50 nmol/L。

3.4 FssDNA與QssDNA2的孵育時間和溫度

固定FssDNA終濃度為25 nmol/L，QssDNA2終濃度為50 nmol/L，在25℃避光孵育10， 20， 30， 40和50 min后進行實驗，結果表明，對于兩種農藥，孵育10 min時ΔI較低，可能是孵育時間若太短時FssDNA與QssDNA2不能充分雜交結合，隨著孵育時間延長，ΔI逐漸升高，但20 min后ΔI趨于穩定，因此確定孵育時間為20 min。

在優化的實驗條件下， 分別在4℃， 25℃， 35℃制備適配體探針復合物，加入農藥進測定熒光信號。對于兩種農藥，當FssDNA與QssDNA2的孵育溫度為35℃時，ΔI均偏低；孵育溫度為4℃和25℃時，ΔI較高。在25℃條件下，水胺硫磷的ΔI比4℃時略有降低，丙溴磷的ΔI比4℃有較大增加，綜合考慮，選擇孵育溫度為25℃。

3.5 農藥與適配體探針復合物的反應時間

在優化的條件下，制備適配體探針復合物，按照2.2.2節的操作加入52 μL 1 mmol/L 農藥后，取100 μL反應溶液于黑色96孔板中，每隔20 min測定一次熒光強度，計算ΔI，進行3次平行實驗。實驗結果表明，隨著反應時間延長，ΔI逐漸升高；當反應時間達到60 min后，ΔI趨于穩定。因此，農藥的反應時間選擇60 min。

3.6 特異性

在優化條件下，考察1 mmol/L水胺硫磷、丙溴磷以及其它5種類似物甲拌磷、氧化樂果、馬拉硫磷、辛硫磷、甲基對硫磷對適配體探針復合物熒光強度的影響，發現馬拉硫磷、辛硫磷、甲基對硫磷的ΔI很小，可以忽略；甲拌磷、氧化樂果的ΔI稍高，約為水胺硫磷、丙溴磷的ΔI 的10%，是因為本研究使用的FssDNA是由前期工作[18，19]中篩選的識別水胺硫磷、丙溴磷、甲拌磷、氧化樂果的廣譜性適配體改造而來。

3.7 標準曲線、檢出限和精密度

終濃度為25～700 μmol/L的不同濃度的水胺硫磷、丙溴磷對檢測體系體系熒光響應（ΔI）的影響如圖3和圖4所示，可見隨著兩種農藥濃度增大，ΔI也逐漸增大，兩種農藥均在50～500 μmol/L濃度范圍內與ΔI呈良好的線性關系，水胺硫磷檢測的相關系數為0.9917，檢出限（LOD，3σ）為11.4 μmol/L；丙溴磷檢測的相關系數為0.9908，檢出限為14.0 μmol/L。對終濃度250 μmol/L的農藥平行測定10次，水胺硫磷的相對標準偏差（RSD）為5.8%，丙溴磷的RSD為4.9%，表明本方法具有良好的精密度。

3.8 樣品分析

采用本方法，進行了水樣中的加標回收實驗，結果見表1，水胺硫磷的加標回收率為86.6%～95.3%，丙溴磷檢測加標的回收率為85.8%～92.6%。

4 結 論

本實驗將核酸適配體與高靈敏的熒光檢測技術有機結合，初步建立了一種水胺硫磷和丙溴磷的熒光檢測方法。與氣相色譜法[20]相比，本方法的檢出限偏高，仍需進一步優化，如對適配體進行修飾等。但本方法對水胺硫磷和丙溴磷有一定的特異性和靈敏度，操作簡單、成本低，可用于農藥制劑及高含量農藥多殘留的快速篩查檢測。

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糙米中50種有機磷農藥殘留量的測定. 中華人民共和國國家標準.GB/T 5009.2072008

Abstract A fluorescence method for detection of isocarbophos and profenofos was established based on the specific recognition of aptamer. The aptamer recognizing isocarbophos and profenofos was labeled with fluorescent label FAM at 5′ end （FssDNA）. When it bound to complementary DNA chain labeled with quenching group DABCYL at 3′ end （QssDNA）， the doublestranded structure would be formed and the fluorescence signals became very weak due to the effect of fluorescence resonance energy transfer. While the QssDNA would be released from the doublestranded structure when the aptamer specifically recognized and bound the targets， and the fluorescence signals of the system would recover. Based on this， isocarbophos and profenofos could be quantitatively detected. The optimized experimental conditions were as follows： firstly， 25 nmol/L FssDNA and 50 nmol/L QssDNA2 were incubated for 20 min at 25℃， then an equal volume of pesticide was added and incubated for another 60 min， then the fluorescence intensity of the system was determined. Under the optimal conditions， the change of the fluorescence intensity of the system （ΔI） showed a linear relationship with the isocarbophos or profenofos concentration in the range of 50 to 500 μmol/L. The limit of detection （LOD， σ） was 11.4 μmol/L for isocarbophos with the relative standard deviation （RSD） of 5.8% （n=10）. The LOD was 14.0 μmol/L for profenofos with RSD of 4.9% （n=10）. The recovery ranged from 85.8% to 95.3% when this method was applied to detect isocarbophos and profenofos in real water samples.

Keywords Aptamer； Fluorescence； Isocarbophos； Profenofos