表面增強(qiáng)拉曼光譜法測(cè)定飲料中4—甲基咪唑和2—甲基咪唑

陳小曼 陳漾 李攻科 胡玉玲 肖小華

摘要：以金納米粒子為拉曼活性基底，采用便攜式拉曼儀進(jìn)行分析，建立了飲料中4甲基咪唑（4MeI）和2甲基咪唑（2MeI）的表面增強(qiáng)拉曼光譜分析法，并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。在最優(yōu)條件下（Na2SO4溶液為團(tuán)聚劑，金納米粒子用量分別為250和200 μL），4MeI和2MeI的線性范圍分別是0.05～5.00 mg/L和1.0～20.0 mg/L，檢出限分別為1.70 μg/L 和0.21 mg/L；將本法應(yīng)用于含焦糖色素飲料中4MeI和2MeI 的檢測(cè)，4MeI含量在0.093～0.110 mg/L之間，2MeI 無檢出?；厥章史謩e為80.2%～82.7%和78.1%～93.5%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7.1%。本方法簡單、快速、準(zhǔn)確，為含焦糖色素飲料中4MeI和2MeI的快速檢測(cè)提供了新方法。

關(guān)鍵詞 ：表面增強(qiáng)拉曼光譜法；4甲基咪唑；2甲基咪唑；焦糖色素；飲料

1 引 言

焦糖色素，又稱焦糖、焦糖色，是一種在食品中廣泛應(yīng)用的著色劑，常用于醬油、飲料、巧克力等食品的著色。在以氨法或硫酸銨法生產(chǎn)的焦糖色素中，4甲基咪唑（4Methylimidazole， 4MeI）和2甲基咪唑（2Methylimidazole， 2MeI）兩種同分異構(gòu)體以副產(chǎn)物的形式存在，且4MeI具有致癌作用[1～4]。1974年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）食品添加劑委員會(huì)規(guī)定，由氨法生產(chǎn)的焦糖色素中4MeI含量不得超過200 mg/kg，亞硫酸銨法生產(chǎn)的焦糖色素中4MeI含量不得超過250 mg/kg。目前，4MeI和2MeI的常用檢測(cè)方法有薄層色譜法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、高效液相色譜法[7，8]、氣相色譜質(zhì)譜法[9～12]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13～15]等。但這些方法大多存在分析時(shí)間長、儀器昂貴、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定食品中4MeI和2MeI的新方法具有重要意義。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surfaceenhanced Raman spectroscopy， SERS）作為一種新型光譜分析技術(shù)，具有靈敏度高、分析速度快、檢測(cè)成本低、檢測(cè)設(shè)備便攜、可實(shí)現(xiàn)原位實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已逐步發(fā)展成為一種具有廣泛應(yīng)用前景的分析檢測(cè)手段，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力[16～22]。本研究采用表面增強(qiáng)拉曼光譜法對(duì)3種含焦糖色素飲料中的4MeI和2MeI進(jìn)行檢測(cè)，為各種含焦糖色素飲料中4MeI和2MeI的快速檢測(cè)提供了新方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

DeltaNu Inspector便攜式拉曼光譜儀（美國DeltaNu公司）；SQP電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；B260型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；SB5200D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；GZX9146 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

4甲基咪唑（98%，百靈威試劑公司）；2甲基咪唑（98%，阿拉丁試劑公司）；KAuCl4·2H2O（含金48%～50%，阿拉丁試劑公司）；檸檬酸三鈉（分析純，沈陽市試劑三廠）；三氯甲烷、無水乙醇、KNO3、Na2SO4等試劑（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；3種飲料（包括風(fēng)味飲料，果蔬飲料和碳酸飲料）購于廣州市海珠區(qū)某超市。

2.2 金納米粒子（AuNPs）的制備

參考文獻(xiàn)＼[23＼]的方法并略有改進(jìn)，將200 mL超純水與1.00 mL 2%（w/w）HAuCl4溶液加入三口圓底燒瓶后，在140℃油浴鍋中加熱攪拌至沸，沸騰5 min后，加入1.48 mL 1%（w/w）檸檬酸鈉溶液，加熱反應(yīng)40 min后移開熱源，冷卻密封保存于暗處，制成的金納米粒子呈紫紅色。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取4MeI和2MeI標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0.0001 g）， 以超純水溶解并定容至10 mL，配制成1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水稀釋，配成50.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間液。以超純水將標(biāo)準(zhǔn)中間液配制成各所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，儲(chǔ)備液于4 ℃貯存。

2.4 樣品處理

量取1 mL樣品于250 mL分液漏斗中，加100 g/L碳酸鈉水溶液5 mL，加三氯甲烷無水乙醇萃取液（8∶2， V/V）20 mL，劇烈振搖5 min。靜置分層后，將有機(jī)相移入另一個(gè)分液漏斗中，水相再按同樣方法萃取一次，合并有機(jī)相；用100 g/L Na2CO3洗滌提取液3次，每次10 mL。將有機(jī)相通過無水Na2CO3濾入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，50 ℃濃縮至近干，以水溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后用于SERS分析[24]。

2.5 分析過程

移取適量金納米粒子、待測(cè)分析液和團(tuán)聚劑于拉曼管中，搖勻后進(jìn)行SERS檢測(cè)。

拉曼儀器參數(shù)：激光功率為60 mW，激光時(shí)間為5 s，激光次數(shù)為1次，每次采譜扣除暗電流1 s，測(cè)試模式為Software，所獲得的拉曼譜圖不扣除熒光。

3 結(jié)果與討論

3.1 特征峰歸屬

3.2.2 團(tuán)聚劑用量的優(yōu)化

適量Na2SO4能使金納米粒子發(fā)生一定團(tuán)聚，從而增強(qiáng)SERS信號(hào)。當(dāng)Na2SO4過量時(shí)，金納米粒子會(huì)發(fā)生過度團(tuán)聚，而大大影響SERS效果。本實(shí)驗(yàn)考察了Na2SO4用量對(duì)4MeI和2MeI分析時(shí)SERS強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，4MeI檢測(cè)的最優(yōu)條件是團(tuán)聚劑Na2SO4濃度為1.00 mol/L， 體積為30 μL；2MeI的最優(yōu)條件是Na2SO4的濃度為0.50 mol/L，體積為100 μL。

3.3.4 試劑加入順序的優(yōu)化

分析物與Na2SO4的加入順序?qū)煞N物質(zhì)的SERS響應(yīng)影響較大。若先加入Na2SO4， 使金納米粒子發(fā)生團(tuán)聚后，再加入分析物，其SERS效果較差；而先將金納米粒子和分析物混合之后，再加入Na2SO4，其SERS效果較好。對(duì)于4MeI和2MeI，后者的SERS強(qiáng)度（以峰面積計(jì)算）分別是前者的7.2倍和9.5倍。因此，試劑的加入順序?yàn)榻鸺{米粒子、分析物、Na2SO4。

3.3.5 分析液酸堿度的優(yōu)化

4MeI和2MeI特征峰峰強(qiáng)度受分析液酸堿度的影響均較大。分別以6 mol/L HCl和10 mol/L NaOH溶液將分析液調(diào)節(jié)為酸性和堿性后，進(jìn)行SERS分析，并與不進(jìn)行酸堿度調(diào)節(jié)的分析液進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，對(duì)于4MeI和2MeI，當(dāng)分析液使用水溶液配制，不進(jìn)行酸堿度調(diào)節(jié)時(shí)，pH≈7，SERS效果最佳。所以，選擇使用水溶液配制分析液，無需另加入酸或堿調(diào)節(jié)溶液酸堿度。

3.3 分析方法建立

3.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用上述方法對(duì)從廣州某超市購買的3種含有焦糖色素的飲料進(jìn)行SERS定量分析檢測(cè)，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)， 驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表2。圖3是3種飲料中4MeI和2MeI分析的SERS譜圖。3種市售飲料中均檢出4MeI，且含量較低，而2MeI尚無檢出。本方法測(cè)定的4MeI和2MeI回收率分別為80.2%～82.7%和78.1%～93.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.9%～7.1%和1.5%～3.6%。

4 結(jié) 論

以檸檬酸鈉還原法制備的金納米粒子為SERS基底，粒子無需濃縮，很好地克服了濃縮后粒子易團(tuán)聚而不穩(wěn)定， 甚至失去增強(qiáng)效果的缺點(diǎn)。通過優(yōu)化團(tuán)聚劑（種類、濃度和體積）、金納米粒子的用量、試劑加入順序、分析液酸堿度等條件，建立了4MeI和2MeI的SERS分析方法，并應(yīng)用于市售含有焦糖色素的飲料中4MeI和2MeI的檢測(cè)。3種飲料均檢出4MeI，而未檢出2MeI。本研究為飲料中4MeI和2MeI的檢測(cè)提供了新方法。

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Abstract A method was developed for the determination of 4methylimidazole （4MeI） and 2methylimidazole （2MeI） in drinks by surfaceenhanced Raman spectroscopy with Au nanoparticle as substrate， and the detection conditions were optimized. Under the optimum conditions， by using sodium sulfate aqueous solution as agglomeration solution， and 250 or 200 μL of Au nanoparticle as substrate， the linear ranges of 4MeI and 2MeI were 0.05-5.00 mg/L and 1.0-20.0 mg/L with detection limits of 1.70 μg/L and 0.210 mg/L， respectively. While applied in the determination of 4MeI and 2MeI in drink with lift caramel， the concentration of 4MeI was determined to be 0.093-0.110 mg/L and 2MeI was not detected. The average recoveries of 4MeI and 2MeI were in the range of 80.2%-82.7% and 78.1%-93.5% with relative standard deviations <7.1%. Above all， this method was turned out to be simple， rapid and sensitive， providing a new method for rapid analysis of 4MeI and 2MeI in drink with lift caramel.

Keywords Surfacedenhanced Raman spectroscopy； 4Methylimidazole； 2Methylimidazole； Lift caramel； Drinks